脂质蓄积调控是生命科学研究领域中的重要课题之一,外源性脂类摄入可以改变细胞内脂质含量或组成,进而影响机体内脂质代谢。二十二碳六烯酸（DHA）作为一种多不饱和脂肪酸,能够改变细胞膜特性,并且可以有效的抑制脂肪细胞中甘油三酯的合成、诱导细胞凋亡以及促进脂质分解。研究发现脂质对病毒的复制、成熟和传播等过程产生影响,在病毒感染的草鱼肾脏细胞（CIK）中,三酰甘油等脂质在某些信号和免疫反应途径（如调节自噬）中明显富集。因此脂质代谢对于鱼类肾脏细胞的免疫及信号调节有着重要的影响。自噬相关蛋白（ATG）,参与调控自噬过程的各个阶段,其中ATG4的主要作用是对LC3进行剪切,并使LC3循环,进而诱导自噬的发生。ATG4四个亚型中,ATG4B对LC3B表现出高度特异性。自噬对维持细胞稳态有着重要的作用,但目前与自噬有关的研究大多集中在哺乳动物细胞、植物细胞和酵母细胞方向上。由于鱼类研究技术等方面的局限性,对鱼类细胞自噬研究相对较少,有关DHA对CIK细胞自噬和脂质代谢的影响尚未见到系统探讨。因此,本论文开展了三个试验,着重探讨了DHA对CIK细胞自噬和脂质代谢的影响,以及分析ATG4B在DHA影响CIK细胞自噬和脂质代谢中的作用。试验一,草鱼ATG4四个亚型的克隆和生物信息学分析。将克隆得到的草鱼ATG4四个亚型进行氨基酸多序列比对发现,草鱼ATG4A（MK359084）、ATG4B（MK370054）、ATG4C（MK370055）和ATG4D（MK370056）分别包含1212、1194、1429和1482 bp的完整CDS,分别编码403、394、475和493个氨基酸,分子量分别为45.9、44.5、52.4和54.6 k Da;草鱼ATG4氨基酸序列从哺乳动物到鱼类高度保守,系统进化树分析表明其亲缘关系与鱼类（斑马鱼和金线鲃）较近,此外ATG4四个亚型分别在心、白肌、头肾和肝脏组织中具有较高的表达水平。试验二,ATG4四个亚型参与DHA对CIK细胞脂质代谢的影响。（1）分别用50、100、200μM的DHA处理CIK细胞24 h,通过尼罗红染色和甘油三酯含量的检测,发现随着DHA浓度增加,CIK细胞中脂滴数量增多,甘油三酯含量增加;实时定量结果显示ATG4家族、ATG5、ATG7、Beclin-1和脂代谢相关基因FAS、ACC、ATGL、HSL mRNA表达水平均增加（P<0.01）;（2）DHA处理CIK细胞的同时,用自噬激活剂（Rapa）激活自噬,与DHA处理组相比较,尼罗红染色显示细胞中脂滴减少,同时细胞内甘油三酯的含量显著降低（P<0.01）;脂生成相关基因FAS和ACC基因mRNA表达水平降低（P<0.01）,脂解相关基因ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA表达水平增加（P<0.01）;（3）CIK细胞先用自噬抑制剂（CQ）预处理4小时后结合DHA处理,尼罗红染色结果显示细胞内脂滴的储蓄增加,同时细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.01）;实时定量结果显示脂质生成相关基因PPARγ、FAS、ACC、CREB和CEBPα和基因mRNA表达水平增加（P<0.01）,脂解相关基因ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA基因表达水平降低（P<0.01）。研究结果表明,DHA处理CIK细胞,增加了细胞中LDs的蓄积,并且诱导自噬和脂解的发生;激活（抑制）自噬可以降低（增加）DHA诱导的CIK细胞脂质蓄积。试验三,ATG4B在DHA调控CIK细胞自噬和脂质代谢中的作用（1）在CIK细胞中过表达ATG4B,与对照组相比,ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG7基因mRNA表达水平升高（P<0.01）,ATG4D的表达水平降低（P<0.01）;过表达ATG4B的同时用DHA处理CIK细胞,与DHA处理组相比,ATG4C、ATG5和ATG7基因mRNA表达水平升高（P<0.01）,ATG4B和ATG4D表达水平降低（P<0.01）,ATG4A表达无显著性差异;（2）过表达ATG4B同时用200μM DHA处理,与DHA处理组相比,ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA表达水平显著升高（P<0.01）,FAS和ACC基因mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。结果表明过表达ATG4B促进DHA诱导CIK细胞自噬同时降低DHA诱导CIK细胞脂质蓄积。综上所述,DHA可以增加CIK细胞的脂质含量,同时还可以诱导自噬的发生。自噬参与了DHA对CIK细胞脂质代谢的影响,激活自噬可以减少DHA诱导的CIK细胞脂质蓄积,过表达ATG4B可以促进DHA诱导的CIK细胞的自噬,并且可以减少脂质的积累。