论文部分内容阅读
【目的】观察低强度脉冲超声对体外全骨髓贴壁筛选法获取的BMSCs增殖的调节作用。探索LIPUS联合TGF-β1促进BMSCs向软骨细胞分化的协同效应。【方法】1.通过分离提取四周龄日本大耳白兔的骨髓液,在体外采用全骨髓贴壁筛选法培养、纯化、扩增,得到足够数量级具备良好生物学活性的BMSCs,光镜下观察BMSCs形态变化、免疫荧光细胞化学染色检测细胞质中II型胶原合成分泌情况、流式细胞仪技术检测BMSCs表面标志物CD34、CD45、CD90、CD105,对细胞表型进行鉴定。2.设定不同刺激强度(30、60、90 m W/cm2)和刺激时间(5、10、15、20 min)的参数组合,对体外培养扩增的第3代BMSCs进行LIPUS刺激,24 h后光镜下观察细胞增殖情况,并采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测不同参数下LIPUS对离体培养的BMSCs增殖的作用,优选出可促进BMSCs增殖的最佳LIPUS参数;3.选取离体培养的第3代BMSCs,分为4组:空白对照组(Blank Control组)、单纯TGF-β1组(T组)、单纯LIPUS组(L组)、TGF-β1+LIPUS组(T-L组)。其中,空白对照组:培养基中不加TGF-β1,不予以LIPUS刺激;单纯TGF-β1组(T组):培养基中加入TGF-β1进行培养,不予以LIPUS刺激;单纯LIPUS组(L组):不加入TGF-β1,予以前期筛选出的最佳参数的LIPUS刺激;TGF-β1+LIPUS组(T-L组):在培养基中加入TGF-β1后给予最佳参数的LIPUS刺激,各组均分别在干预的第1、3、7天后观察,应用免疫荧光细胞化学染色检测细胞质中II型胶原的合成分泌情况,应用番红O-固绿染色检测软骨细胞外基质的合成分泌情况,应用RT-PCR法检测细胞SOX9、COL2A1、MMP13 m RNA的表达情况。【结果】1.体外分离培养的BMSCs生长状态良好,贴壁能力强,光镜下观察,稳定增殖后的细胞形态呈梭形或纺锤形,大小形态较为一致。免疫荧光细胞化学染色显示:COL-II染色呈阴性,流式细胞仪技术检测显示:BMSCs均一表达CD90和CD105,阳性率分别为99.78%和99.52%,而CD34和CD45的阳性率分别为0.35%和0.56%,确认培养的细胞为表型稳定的未分化BMSCs。2.不同参数组LIPUS刺激细胞后24 h镜下观察:LIPUS刺激后的细胞呈漩涡状排列,整体分布更加紧密,形成很多BMSCs集簇,尤以超声强度60m W/cm2,作用时间15 min最为明显。CCK-8法检测结果显示:不同参数LIPUS刺激后BMSCs增殖情况均优于空白对照组,其中超声强度60 m W/cm2,作用时间15 min组细胞的OD值均数最大,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.免疫荧光细胞化学染色显示:空白对照组可见COL-II染色呈阴性,而T组和L组的COL-II染色呈阳性,其中,T-L组最显著。番红O-固绿染色:空白对照组的细胞外基质中在第1、3、7天都未见明显的红染出现;而L组和T组细胞外基质中第1天出现较少量红染,第3、7天红染区逐渐增多;T-L组细胞外基质中第1、3、7天均有红染出现,且红染区呈现逐渐扩大的趋势。RT-PCR结果显示:实验组各组在第1、3、7天SOX9和COL2A1表达上调,而MMP13的表达量下调,T-L组的SOX9和COL2A1表达上调量和MMP13下调量更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.通过全骨髓贴壁筛选法可获得生物活性良好、增殖能力强、形态一致、表型稳定的BMSCs,全骨髓贴壁筛选法操作简单、易于掌握,对获得优质BMSCs种子细胞具有重要意义。2.自行构建的低强度脉冲超声刺激细胞装置符合实验需求。适宜参数的低强度脉冲超声可促进离体培养的兔骨髓间充质干细胞增殖,促细胞增殖效应与超声刺激参数有相关性,本研究中,超声强度60 m W/cm2,作用时间15 min促增殖效率最佳。3.单独应用LIPUS和TGF-β1均可促进软骨细胞外基质合成,促进BMSCs向软骨细胞分化,当将LIPUS和TGF-β1联合应用时,二者对促进BMSCs向软骨细胞分化具有协同效应。