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目的:肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)为一种常染色体隐性遗传疾病,其病因为患者ATP7B基因的突变使得ATP依赖性的铜转运蛋白表达降低,进而导致体内铜转运和排泄障碍,体内多余的铜主要蓄积在肝脏、肾脏、大脑等器官,造成这些器官不同程度的损伤。肝豆汤(Gandou decoction,GDD)应用于临床治疗HLD已有数十年历史,临床疗效明确,但由于缺乏肝豆汤质量控制方法和药效学系统研究,限制了其临床应用。本论文首先建立了GDD的HPLC指纹图谱及其8种主要成分的含量测定方法,对肝豆汤质量进行有效控制;通过复制铜负荷HLD大鼠模型,肝脏组织HE染色法观察肝豆汤保护作用,测定不同剂量GDD对HLD模型大鼠血液、肝脏、尿液及粪便中铜浓度,研究GDD排铜效果;测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)活性以及肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)以及总抗氧化能力(T-AOC)等相关指标,考察GDD对模型大鼠代谢酶和脂质过氧化损伤的影响,本论文研究可为肝豆汤质量控制和临床用药提供依据。方法:优化肝豆汤HPLC色谱条件,建立GDD的HPLC指纹图谱及8种代表性的成分(槲皮素、芦荟大黄素、大黄酸、山奈素、姜黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量测定方法,对肝豆汤质量进行有效控制。复制铜负荷HLD大鼠模型,肝组织HE染色观察组织学变化,原子吸收法测定模型大鼠肝脏,血液,尿液和粪便中铜含量,考察GDD对模型大鼠体内排铜效果;试剂盒(微板赖式法)测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,AKP试剂盒(微量酶标法)测定大鼠血清中碱性磷酸酶(AKP)水平;超氧化物歧化酶法测定大鼠肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)活性;氧化应激试剂盒测定肝脏中谷胱甘肽(GSH)(微板法)水平和总抗氧化能力(T-AOC)(ABTS法)水平,考察GDD对铜负荷HLD大鼠的肝保护作用。结果:(1)优化得到肝豆汤指纹图谱色谱条件为:Agilent Eclipse Plus SB-C18(4.6mm×250 mm,5μm)色谱柱;0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱;流速:1.0m L/min;柱温:30℃;进样量:3μL;检测波长:260 nm,共确定30个共有峰,10批肝豆汤样品所得色谱图进行指纹图谱相似度均大于0.980。建立了8种代表性化学成分的HPLC含量测定方法,方法学考察结果表明,该方法线性良好,具有较好的精密度、稳定性、回收率,重现性良好,可用于肝豆汤质量控制。(2)复制铜负荷HLD大鼠模型,以不同剂量灌胃肝豆汤,HE染色结果表明GDD干预后肝脏细胞损伤明显小于模型组。与模型组相比,肝豆汤可显著降低HLD模型大鼠肝脏和血液中铜含量,同时提高尿液和粪便中铜排泄量。模型组与正常对照组相比,血清ALT,AST,AKP活性显着增加(P<0.05);给予中剂量(1.30 g/kg/d)和高剂量(2.60 g/kg/d)肝豆汤后,与模型组相比,血清中ALT,AST,AKP活性均显着降低(P<0.05)。模型组与正常对照组相比,肝脏组织中SOD活性和GSH、T-AOC水平均显著降低(P<0.01)。给予中剂量(1.30g/kg/d)和高剂量(2.60 g/kg/d)肝豆汤后,肝脏组织中SOD活性和GSH、T-AOC水平均显著增加(P<0.01 or P<0.05)。结论:本文建立的肝豆汤HPLC指纹图谱结合多成分含量测定方法,稳定可靠且重现性好,含量测定方法具有较好的精密度、稳定性和重现性,为肝豆汤的质量控制标准提供了依据。排铜保肝作用的研究表明肝豆汤不仅可显著促进铜负荷HLD尿液铜排泄,而且可促进粪便铜排泄,降低血液和肝脏中铜含量,降低负荷HLD大鼠体内铜累积。同时肝豆汤还可通过改善肝脏中酶代谢和发挥抗氧化应激作用,有效缓解铜负荷HLD大鼠的肝损伤。