猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道疾病为主要特征的高度接触性传染疾病,是目前严重危害我国养猪业的主要传染病之一。鉴于目前还尚未有有效的治疗措施,大多猪场采取疫苗免疫、加大抗体水平监测力度、完善猪场管理饲养方式等生物安全措施进行防控。因此,在病毒感染早期实现对该病的快速准确诊断,能够最大限度的控制PRRS的发生和流行。本研究根据我国当前以HP-PRRSV株、NADC30-like株等北美型PRRSV毒株为主要流行毒株的流行现状和已有的抗北美型PRRSV毒株M蛋白的单克隆抗体,对建立一种能够快速检测北美型PRRSV毒株M蛋白抗体的竞争ELISA方法进行了深入的研究,并在此基础上开展了针对该单抗识别表位的标记疫苗的初步探索性研究。本研究主要内容包括:1.北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立及初步应用以纯化的PRRSV全病毒(HuN4-F112株)为包被抗原,利用抗北美型PRRSV毒株M蛋白的特异性鼠源单克隆抗体为竞争抗体,经条件优化,建立了一种特异性检测北美型PRRSV毒株M蛋白抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示,最佳抗原包被量为660 ng/孔,待检血清样本稀释度为1:2,竞争抗体最佳稀释度为1:8。ELISA结果判定标准:血清样本抑制率PI≥25.65%时判定为阳性,PI<25.65%判定为阴性。特异性试验显示,本方法仅能检测北美型PRRSV毒株抗体,且与欧洲型PRRSV(DV株)及PRV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV等猪病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验显示,本方法能检测出128倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。用该方法对黑龙江地区收集的546份临床血清样品进行检测,PRRSV抗体阳性率达95.1%,与商品化IDEXX PRRSV试剂盒的符合率为95.8%。本研究建立的ELISA方法为PRRSV的流行病学调查、临床上疫苗评估及免疫前后抗体水平监测提供了有效的检测手段。2.北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白表位缺失株的研究利用反向遗传学技术,在高致病性PRRSV疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,根据已鉴定出的PRRSV M蛋白抗原表位(~3SSLD~6),对该表位进行缺失突变构建出带有缺失标记的PRRSV M蛋白(~3SSLD~6)表位缺失株。通过细胞病变观察、间接免疫荧光实验、蛋白免疫印迹实验、缺失和标记位点测序及酶切鉴定,证明成功拯救出3株M蛋白表位缺失病毒。进一步比较拯救病毒与亲本病毒的病毒滴度、增殖动力学曲线、遗传稳定性、动物实验抗体产生水平等生物学特性,对此拯救病毒进行体外和体内评价。结果证明虽然在体外可以将M蛋白表位缺失病毒和亲本病毒区分开来,但是动物实验结果显示,构建的M蛋白表位缺失病毒产生的免疫血清,并不能与未缺失的亲本病毒通过ELISA检测方法进行抗体鉴别诊断区分,需要进一步探究其抗体产生机制,这为研制有效的标记疫苗提供了相关参考数据,奠定了相关研究基础。