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研究背景目前全球患有哮喘人数超过3亿,其患病率与死亡率猛速增加,寻求有效的治疗手段刻不容缓,而最根本的治疗突破点离不开机制的探索。慢性炎症和气道高反应是哮喘发病的主要机理,近年来关于气道重塑及控制气道重塑的药物研发迎来了高峰。人抗原R(Human antigen R,HuR)是一种RNA结合蛋白,主要通过与目的基因的3’UTR结合发挥功能,包括COX-2、CyclinD、VEGF、p53等。研究HuR与TGF-β1对哮喘气道重塑发生发展的机制是本课题的核心,旨在为哮喘控制方面提供新的方向。在本研究中,Western印记、PCR、免疫荧光等发现在PDGF刺激下,气道平滑肌细胞HuR、TGF-β1、α-SMA和COI-I表达呈时间依赖性。利用RNA干扰技术阻断HuR表达后,TGF-β1、α-SMA和COI-I表达降低。然而,利用RNA干扰技术降低TGF-β1表达,HuR、COI-I表达也明显降低,并且额外增加TGF-β1刺激,HuR和COI-I表达可部分恢复。综合以上分析,我们猜测在气道平滑肌细胞内可能存在HuR/TGF-β1的反馈调节,且此反馈调节对哮喘状态下气道重塑的发生发展有影响。分别用OVA和PBS刺激BALB/c小鼠以构建哮喘小鼠和对照。研究发现,OVA诱导的哮喘小鼠,HE染色发现小鼠肺实质及气道周围大量炎症细胞的聚集,Western印记、RT-PCR及免疫组织化学技术均证实在OVA诱导的哮喘小鼠,肺组织内高表达HuR、TGF-β 1,从而在小鼠体内证实了 HuR、TGF-β 1对气道重塑的作用。目的1.采用Western印记、RT-PCR、免疫组织化学等检测气道平滑肌细胞内HuR、TGF-β1等的表达。2.siRNA干扰HuR,检测ASM形态学及功能学改变。此外,利用特异siRNA干扰TGF-β1表达或者增加外源性TGF-[β1刺激ASM,检测HuR、α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达,探讨HuR及TGF-β1对气道重塑的作用。3.探讨哮喘小鼠体内HuR与TGF-β1对气道重塑的作用。方法1.PDGF(20μg/L)分别刺激气道平滑肌细胞0、6、12和24h。分别检测各时间点细胞内相关指标RNA水平及蛋白表达水平。RNA干扰技术分别阻断HuR、TGF-β1表达,Western印迹检测干扰效率,探讨HuR与TGF-β1之间的作用。2.为探讨哮喘小鼠气道重塑发生与HuR/TGF反馈调节的作用,BALB/c小鼠分别用卵蛋白(OVA)和PBS致敏,收集肺泡灌洗液检测炎性细胞。切取小鼠肺组织采用Western印记、RT-PCR和免疫组织化学检测HuR、TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达。结果1.PDGF分别在0、6、12和24h刺激培养的气道平滑肌细胞,与Oh相比,细胞内TGF-β1 RNA水平分别增加了 27%,60%和87%(P<0.05),蛋白表达分别增加了 31%,69%和106%(P<0.05),α-SMA和胶原酶Ⅰ表达也随时间依递增。表明哮喘状态下TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ呈时间依赖性表达。2.干扰HuR表达,干扰组细胞凋亡率(3.315%)较对照组(1.236%)增加(P<0.05),HuR可能参与调控ASM形态学改变。干扰组细胞内及细胞上清中TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ表达较对照组显著降低(P<0.05)。进一步给予平滑肌细胞actinomycinD刺激,发现干扰组TGF-β1 mRNA稳定性较对照组明显降低(P<0.05)。因此我们推测HuR主要通过增加TGF-β1 mRNA稳定性从而调控TGF-β1表达并进而影响α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达。3.siRNA干扰TGF-β1后,CCK8检测发现干扰组细胞增殖明显降低,细胞内TGF-β1表达较对照组也降低了 23.8%,然而增加外源性TGF-β1(4ng/ml)刺激,HuR和COI-I表达恢复,说明TGF-β1参与调控HuR与COI-I的表达。4.OVA组小鼠肺组织内炎性反应较PBS组更显著,OVA组诱导的小鼠BALF内细胞总数 7.56 ± 1.53 × 106/ml,其他细胞如 Macrophages、Eosnophils、Lymphocytes 及 Neutrophils 所占比例依次:28.20 ± 1.95%,35.40 ±2.02%,26.70±2.38%和 7.08±0.74%,PBS 刺激组小鼠 BALF 内细胞总数 3.69±0.98×106/ml,相应细胞所占的比例依次:68.88±2.73%,6.25±0.95%,18.12±1.58%和3.02±0.63%。(P<0.05)。Sirius Red Staining 发现 OVA 组小鼠肺间质内弥漫Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积。5.PCR、Western印记联合免疫组织化学共同显示OVA组小鼠肺组织内高表达HuR、TGF-β1等,在小鼠进一步证实了 HuR与TGF-β1对气道重塑的作用。结论1.HuR与TGF-β1共同调控α-SMA和COI-I的表达,从而影响气道重塑。2.HuR、TGF-β1和α-SMA在哮喘小鼠肺组织内高表达,肺间质内存在大量Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积。