第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定和体外体内的示踪研究实验一大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定,为进一步的研究打下基础。方法取SD大鼠双侧股骨骨髓,分别采用全骨髓贴壁培养法和密度梯度离心法(应用60%PERCOLL淋巴细胞分离液)培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行传代、扩增,对细胞的形态学及生长特性进行观察,并应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90以及CD11b进行表型鉴定。结果两种方法培养的细胞均为成纤维细胞样,集落生长,全骨髓培养法培养的BMSCs表达CD34-(95.4%),CD44+(94.2%),CD45-(91.6%),CD29+(93.8%),CD90+(98%)和CD11b-(87.6%);梯度离心法培养的BMSCs表达CD34-(96.9%),CD44+(97.3%),CD45-(97.5%),CD29+(99.4%),CD90+(99.8%)和CD11b-(96%)。全骨髓贴壁培养简单易行,原代培养周期较短,但密度梯度离心法培养的BMSCs更加纯化。结论两种方法均可分离培养出较纯化的BMSCs,造血干细胞和内皮细胞表面标志抗原CD34、CD45、CD11b均表达阴性,间充质干细胞表面标志抗原CD44、CD29、CD90均表达阳性,这些细胞可用于进一步的实验。实验二CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞体外体内的示踪研究目的建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察,为进一步的研究提供依据。方法应用CM-DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs,应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察;8只SD大鼠,制作急性心肌梗死模型,将已标记CM-DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠,在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片,并在荧光显微镜下观察移植细胞;于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43(connexin43)的表达。结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100%,标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响,形态无改变,经过传代培养14天仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周,心肌组织冰冻切片可找到移植细胞,CM-DiI与BMSCs结合稳定,荧光标记效果维持一个月无明显衰退,免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。结论CM-DiI细胞标记液标SEBMSCs,对细胞生长特性无影响,操作简单,标记效果好,BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活,并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM-DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。第二部分冠心Ⅱ号联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死的影响目的本实验通过观察冠心Ⅱ号联合BMSCs移植对大鼠急性心肌梗死模型心功能、血管再生和心肌纤维化的影响,并与单纯BMSCs移植比较,探讨冠心Ⅱ号和BMSCs移植对急性心肌梗死是否有协同治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨,为冠心Ⅱ号在提高干细胞移植治疗心肌梗死疗效方面的应用提供依据。方法74只SD大鼠随机分为5个实验组:(1)正常对照组(n=10):不制作心肌梗死模型,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(2)模型组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养基,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(3)冠心Ⅱ号组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射L-DMEM培养基,用冠心Ⅱ号汤剂(相当于生药10g/kg体重)灌胃,1次/天,共一周。(4)BMSCs组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射2×10~6个已标记CM-DiI的BMSCs,用生理盐水灌胃,1次/天,共一周。(5)冠心Ⅱ号+BMSCs组(n=16):制作急性心肌梗死模型,在心肌梗死区及边缘区分5点注射2×10~6个已标记CM-DiI的BMSCs,用冠心Ⅱ号汤剂(相当于生药10g/kg体重)灌胃,1次/天,共一周。4周后,进行如下检测:(1)多普勒超声心动图检测心功能,记录左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。(2)Masson三色染色法检测左心室心肌纤维化改变;(3)心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察移植的BMSCs。(4)免疫组织化学法检测心梗边缘区组织VWF和VEGF的表达,计算心肌微血管密度。(5)荧光定量RT-PCR检测心肌梗死边缘区TGFβ1mRNA、VEGF mRNA的表达水平。(6)酶联免疫吸附法检测血清中Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢNP)的浓度。结果(1)各组死亡例数:模型组4例,冠心Ⅱ号组3例,MSCs组4例,冠心Ⅱ号+MSCs组3例。4组比较无显著差异(P＞0.05)。最终进入心功能检测的动物为60例,正常对照组10例,模型组12例,冠心Ⅱ号组13例,MSCs组12例,冠心Ⅱ号+MSCs组13例。(2)心功能比较:心梗后4周,除正常对照组外,其余组别大鼠均出现不同程度心脏室壁收缩幅度降低,左室前壁无运动或运动减弱,射血分数及左室短轴缩短率降低,心腔不同程度扩张,以模型组最为严重。模型组、冠心Ⅱ号组、BMSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组的LVIDd、LVIDs、FS、EF与正常对照组比较,均有显著统计学意义(P＜0.01);三组治疗组与模型组比较,LVIDd和LVIDs明显缩短(P＜0.05,P＜0.01),心功能明显改善(P＜0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组与MSCs组相比较,LVIDs显著缩短(P＜0.05),FS明显提高(P＜0.01),EF也显著提高(P＜0.05)。(3)Masson三色染色切片显示,正常对照组未见梗死灶和纤维形成,心肌排列整齐,其余各组均出现大小不等的心肌梗死灶,被染成蓝色的胶原纤维增生代替梗死区域,形成瘢痕,梗死区域室壁变薄。胶原含量及纤维化程度依次为:模型组＞冠心Ⅱ号组＞MSCs组＞冠心Ⅱ号+BMSCs组。(4)MSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组左心室心肌梗死边缘区组织冰冻切片,荧光显微镜下均可找到发出红色荧光的移植细胞。其余各组未见阳性细胞。(5)在三个治疗组,均可见到VWF、VEGF表达增多,并可见新生血管形成。与正常对照组相比,各组的VEGF表达增强,MVD显著增加(P＜0.01);各治疗组与模型组相比较,VEGF表达增强,MVD增加,均有显著性差异(P＜0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组与BMSCs组比较,VEGF表达和MVD均有显著性差异(P＜0.01)。(6)各个心梗造模组心肌组织TGFmRNA、VEGFmRNA表达水平均显著高于正常对照组(P＜0.01);三个治疗组TGFβ1mRNA表达水平低于模型组(P＜0.01),VEGFmRNA表达水平高于模型组(P＜0.01);与BMSCs组比较,冠心Ⅱ号+BMSCs组TGFβ1mRNA表达水平较低((P＜0.05),VEGFmRNA表达水平较高(P＜0.01)。(7)心肌梗死造模后,血清PⅠCP、PⅢNP水平均显著性升高,显示体内的Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成增加。与模型组相比,冠心Ⅱ号组、BMSCs组和冠心Ⅱ号+BMSCs组血清PⅠCP、PⅢNP水平均有显著性降低(P＜0.01);冠心Ⅱ号+BMSCs组血清PⅠCP、PⅢNP水平和冠心Ⅱ号组、BMSCs组相比较,均有显著下降(P＜0.01)。表明冠心Ⅱ号联合BMSCs移植可有效减少心肌梗死区胶原合成,减少了PⅠCP、PⅢNP的释放。结论(1)冠心Ⅱ号汤剂、BMSCs移植和冠心Ⅱ号联合BMSCs移植等3种方法均可改善心肌梗死大鼠心功能,减少心室扩张程度,但以联合组效果最佳。冠心Ⅱ号和BMSCs移植对心肌梗死有协同治疗作用。(2)冠心Ⅱ号汤剂、BMSCs移植和冠心Ⅱ号联合BMSCs移植等3种方法均可促进心肌梗死后新生血管形成,而冠心Ⅱ号可促进BMSCs移植后的血管新生,增加移植细胞区域的血供,改善了移植细胞的生存环境。这可能与其促进VEGF分泌和上调VEGF基因的表达有关。(3)3个治疗组均可减少心梗后胶原形成,减少心肌纤维化,减轻心室重塑,但以冠心Ⅱ号联合BMSCs移植组效果最佳,可能与下调TGFβ1基因的表达有关。