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研究目的与意义急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是一种严重的临床综合征,具有很高的发病率和死亡率。AKI的诱发原因很多,如肾毒性药物、肾缺血再灌注、脓毒症等。尽管AKI的发病机制十分复杂,越来越多的研究证实炎症反应在其中发挥了重要作用。固有免疫系统是人体的第一道防线,其主要功能是通过起始免疫反应清除病原体并介导损伤组织的修复。固有免疫系统可经模式识别受体识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)而激活。在AKI中,模式识别受体的异常激活会导致过强的炎症反应,造成组织损伤。但目前尚无有效的方法预防和治疗AKI。因此,开发新型的预防和治疗AKI的策略迫在眉睫。颗粒蛋白前体(progranulin, PGRN)是一种由593个氨基酸构成的自分泌性生长因子,结构上由七个半富含半胱氨酸的结构域构成。PGRN的表达十分广泛,除在上皮细胞、巨噬细胞中高表达外,在其他的一些组织和细胞中也有表达,如骨骼肌、脂肪组织、造血细胞、T细胞、树突状细胞等。PGRN具有多种生物学功能,并广泛参与多种疾病进程,如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、肿瘤等。近年来,PGRN的抗炎作用受到广泛关注。在急性感染模型中,PGRN可以抑制脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的巨噬细胞细胞因子的释放。PGRN在慢性炎症中也具有保护作用,重组PGRN可以显著减轻类风湿性关节炎动物模型中的炎症反应。此外,最近的一项研究报道,PGRN可以与Toll样受体9 (Toll-likereceptor 9, TLR-9)结合,提高固有免疫系统清除病原微生物的能力。炎症反应是AKI的重要机制,然而PGRN在AKI中的表达与功能尚不清楚。因此,深入探讨PGRN在AKI的作用具有十分重要的意义。研究方法1 PGRN在肾缺血再灌注模型中的表达变化1.1小鼠肾缺血再灌注模型的构建及PGRN的检测选取12周龄雄性野生型(wild type, WT) C57BL/6、PGRN缺失型Grn-/-) (B6(Cg)-Grntml.lAidi/J)以及NOD2缺失型(Nod2-/-) (B6.129S1-Nod2tmlFlv/J)小鼠。使用戊巴比妥钠麻醉小鼠后,沿中线切开腹腔,使用微动脉夹夹住双侧肾蒂30分钟(min),之后移去动脉夹,观察5min,确保血液复流,开始计时,12、24、48、72小时(h)后,处死小鼠,取材。使用蛋白质免疫印迹法(western blot, WB)、Real-time RT-PCR和免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测PGRN在肾缺血再灌注肾组织中表达变化。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠血清中的PGRN。1.2 PGRN与肾小管不同部位标记物的共定位采用组织免疫荧光(immunofluoresce, IF)方法对PGRN与肾小管不同部位的标记物蛋白进行荧光双染。1.3体外模型的建立及PGRN的检测体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)；采用三种方法模拟低氧环境,分别是：低氧培养箱培养2h,之后转为正常培养；抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理细胞90min,之后转为正常培养；不同浓度氯化钴(CoCl2)处理12h。WB检测三种条件下HK-2细胞中PGRN的蛋白水平的变化。2 PGRN在小鼠肾缺血再灌注损伤中的功能2.1野生型与Grn-/-小鼠肾脏功能学指标对比安捷伦1100高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)系统测定野生型与Grn-/-。小鼠血清中肌酐的含量。罗氏cobas 8000全自动生化分析仪测定野生型与Grn-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型与Grn-/-小鼠肾脏形态学损伤对比苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, H&E)对野生型与Grn-/-小鼠肾脏石蜡切片染色,并对其形态学损伤进行评分。原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL)对野生型与Grn-/-小鼠肾脏石蜡切片染色。2.3小鼠肾缺血再灌注模型炎症相关指标的检测ELISA检测野生型与Grn-/-小鼠肾匀浆中促炎因子的含量。IHC检测野生型与Grn-/-小鼠肾脏切片中性粒细胞标记蛋白Ly6B,巨噬细胞标记蛋白CD68。2.4重组PGRN对抗霉素A/2-脱氧葡萄糖诱导的HK-2细胞炎症及凋亡的影响Real-time RT-PCR检测重组PGRN对抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理条件下HK-2细胞炎症反应的影响。Annexin V/PI染色后,使用流式细胞术检测重组PGRN对抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理条件下HK-2细胞凋亡的影响。Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性,WB检测Bcl-2及Bax的蛋白水平。2.5外源注射重组PGRN对小鼠肾缺血再灌注损伤的影响对野生型与Grn-/-小鼠术前6h、术后6h及术后12h分别注射重组PGRN。检测小鼠血清中肌酐与尿素氮的含量。H&E染色方法对小鼠肾脏石蜡切片进行形态学染色。IHC检测小鼠肾脏切片中性粒细胞标记蛋白Ly6B,巨噬细胞标记蛋白CD68。 ELISA检测小鼠肾匀浆中促炎因子的含量。3 PGRN对NOD2信号通路的影响WB检测野生型与Grn-/-小鼠肾脏NOD2的蛋白水平。WB检测重组PGRN对小鼠肾脏NOD2蛋白水平的影响。WB检测重组PGRN对抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理条件下NOD2表达的影响。WB检测重组PGRN对MDP (NOD2激活剂)诱导的HK-2细胞NF-κB信号通路相关蛋白的影响。IF检测HK-2细胞中p65的定位与转位。Real-time RT-PCR检测重组PGRN对MDP诱导的HK-2细胞促炎因子mRNA水平的影响。4 PGRN在顺铂诱导的小鼠AKI中的功能研究4.1顺铂诱导的小鼠AKI模型构建及PGRN的检测选取12周龄WT(C57BL/6)、Grn-/-(B6(Cg)-Grntml.lAidi/J)雄性小鼠,腹腔注射顺铂(30mg/kg体重)构建AKI模型。WB检测顺铂诱导的小鼠AKI模型肾脏组织中PGRN的蛋白水平。4.2 PGRN缺失对顺铂诱导的AKI的影响测定野生型与Grn-/-小鼠血清中肌酐的含量。H&E染色方法对野生型与Grn-/-小鼠肾脏石蜡切片染色,并对其形态学损伤进行评分。4.3外源性注射重组PGRN对顺铂诱导的小鼠AKI的影响对野生型小鼠顺铂注射前6h注射重组PGRN。检测小鼠血清中肌酐的含量。H&E染色方法对小鼠肾脏切片进行形态学染色,并对其形态学损伤进行评分。4.4重组PGRN对川页铂诱导的HK-2细胞炎症及凋亡的影响WB检测顺铂诱导下HK-2细胞PGRN蛋白水平的变化,Real-time RT-PCR检测PGRN对顺铂诱导的HK-2细胞促炎因子的影响。流式细胞术检测检测重组PGRN对顺铂诱导HK-2细胞凋亡的影响。研究结果1 PGRN在肾缺血再灌注模型中的表达变化1.l小鼠肾缺血再灌注损伤模型肾脏中PGRN水平显著降低Real-time RT-PCR及WB检测小鼠肾脏中PGRN的表达。结果显示,肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中的PGRN的mRNA与蛋白水平较假手术组显著下降,这一结果在IHC结果中得到了证实。1.2 PGRN主要表达在肾皮质与外髓质近曲小管与远曲小管中IF检测发现,PGRN主要表达在。肾皮质与外髓质近曲、远曲肾小管中,在髓质集合管中表达较弱。1.3体外模型条件下PGRN的蛋白水平显著降低采用三种方法模拟低氧即低氧培养、抗霉素A/2-脱氧葡萄糖、CoCl2处理HK-2细胞。三种模拟低氧条件下,PGRN的蛋白水平均显著下降。2 PGRN在肾缺血再灌注损伤中具有保护作用2.1 PGRN缺失加重了肾缺血再灌注损伤Grn-/-小鼠较野生型小鼠血清中肌酐水平更高；肾脏损伤更加严重,细胞死亡数更多；肾脏匀浆中促炎介质的水平更高,浸润的中性粒细胞及巨噬细胞的数量更多。2.2外源重组PGRN减轻肾缺血再灌注损伤对野生型与Grn-/-小鼠术前6h注射重组PGRN可以显著的减轻肾缺血再灌注损伤,表现为血清中的肌酐尿素氮水平降低；肾脏形态学损伤减轻；肾脏匀浆中促炎介质的水平降低；浸润的中性粒细胞及巨噬细胞的数量减少。术后6h、12h注射重组PGRN也可以起到一定的保护作用。2.3重组PGRN减轻A/2-脱氧葡萄糖诱导的HK-2细胞的炎症反应与凋亡PGRN显著降低抗霉素A/2-脱氧葡萄糖诱导的HK-2细胞中促炎因子的升高、凋亡细胞的增多、Caspase-3的活性以及Bax与Bcl-2的比例的增加。3 PGRN负调控NOD2介导的信号通路PGRN的缺失使得肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中NOD2的蛋白水平进一步升高。对小鼠注射重组PGRN可以降低肾脏中的NOD2的蛋白水平,这一结果也在体外实验中得到证实。MDP激活HK-2细胞中的NF-κB信号通路,表现为p65、IκB的磷酸化；IkB的降解以及p65的入核,这些过程均可被PGRN所抑制。PGRN还可以抑制MDP诱导的HK-2细胞促炎因子的升高。4 PGRN减轻顺铂诱导的AKI体内与体外实验结果显示,顺铂可以降低PGRN的蛋白水平。PGRN的缺失导致顺铂诱导的AKI更加严重。重组PGRN可以显著减轻顺铂诱导的AKI。体外实验显示,重组PGRN可以抑制顺铂诱导的HK-2细胞促炎因子的升高。研究结论与创新性1.本研究首次表征PGRN在AKI中的表达变化,发现肾缺血再灌注损伤小鼠肾脏中PGRN的表达水平显著降低,进一步发现PGRN缺失加重肾缺血再灌注损伤,重组PGRN对缺血再灌注引起的肾损伤具有明显的防洛作用。这一结果同样在顺铂诱导的AKI模型中得到证实。本研究为设计和开发PGRN相关蛋白质药物并更好地应用于AKI的防治提供重要的实验基础和理论依据。2.本研究首次发现PGRN可以负调控NOD2介导的信号通路,证明了PGRN的肾脏保护作用至少部分依赖于其对NOD2信号通路的负调控作用。本研究有助于进一步阐明模式识别受体在AKI中的作用,并提出针对模式识别受体介导的炎症反应进行疾病干预的可能性。