阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以学习记忆障碍为主要特征的神经系统退行性疾病,是21世纪面临的严重的医学和社会问题。其特征是认知能力受损、行为异常和人格改变,症状往往随着年龄的增长而恶化,从轻度记忆障碍逐渐发展为严重的痴呆,其潜伏期加上平均病程一般约为7至10年。该病在现代社会的老龄群体中十分常见,且目前缺乏有效治疗手段,已经成为老年人死亡的重要原因之一,对老年人健康危害极大,并造成较重的家庭和社会负担。因此,如何控制和治疗AD已成为一个刻不容缓的世界性研究课题。氧化应激作为在神经退行性疾病发生过程中发挥潜在作用的一个重要因素,一直备受科学家的重视。近年来研究者们逐渐把目光聚焦于传统中药的神经保护和抗氧化等作用,试图找到预防或治疗AD的入口。中药山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果实,始载于《神农本草经》,具有补益肝肾和涩精固脱的功效,是我国传统的名贵中药,也是六味地黄丸、金匮肾气丸和左归丸等中药名方中主要组成药材之一。山茱萸新苷(Cornuside)是山茱萸中主要的环烯醚萜苷类成分之一,关于其药理研究较少,仅有的几篇文献分别报道了其抗炎、抗凋亡和调节线粒体功能障碍等作用。本课题组前期研究发现,Cornuside具有抑制过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用,但是关于改善氧化应激所致的认知障碍未见相关报道,更无相关研究阐明其发挥作用的机制和靶点,而山茱萸和山茱萸环烯醚萜苷类成分均被报道有很好的抗氧化作用和改善认知障碍作用。基于此,我们决定从氧化损伤的角度入手,探讨Cornuside改善认知障碍的作用及相关的分子机制。第一部分山茱萸新苷对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究目的探讨中药山茱萸中化合物Cornuside对SH-SY5Y神经细胞生长的影响及对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。方法体外培养的SH-SY5Y细胞与Cornuside(0.3、1、3μmol/L)作用 2 h 后,加入 H2O2 300 μmol/L 作用 12 h 诱导SH-SY5Y细胞产生氧化损伤。显微条件下观察细胞形态;CCK8法检测细胞存活率;DPPH法检测Cornuside的体外抗氧化能力;分光光度计法测定LDH释放率;荧光显微镜检测胞内ROS水平;分光光度计法检测胞内SOD活力、GSH水平和MDA含量;JC-1法检测线粒体膜电位;Hochest 33258和AO/EB染色法检测细胞凋亡情况。结果体外实验表明Cornuside具有一定的清除自由基的作用,其EC50值为2.01×10-5 mol/L;Cornuside 在 0.01-30 μmol/L 条件下对正常 SH-SY5Y 细胞不产生毒性作用;与H2O2损伤组相比,Cornuside在0.3、1和3 μmol/L条件下可呈浓度依赖性地提高细胞存活率,并明显改善细胞受损形态和凋亡水平;同时Cornuside能降低LDH渗漏率并升高线粒体膜电位;此外,Cornuside还能提高胞内抗氧化酶水平和GSH含量,减少丙二醛的产生,在浓度为1 μmol/L时效果最佳,其抗氧化损伤效果与VE相当。第二部分山茱萸新苷对D-半乳糖致学习记忆障碍模型小鼠的体内药效学研究目的探讨中药山茱萸中化合物Cornuside对D-半乳糖致学习记忆障碍模型小鼠的影响。方法采用D-半乳糖模型,此模型与氧化应激损伤密切相关并影响学习和记忆功能。选用2月龄雄性昆明小鼠,按体重随机分为Control、Model、Cornuside(3,12.5,50 mg/kg)组、阳性药多奈哌齐(1 mg/kg)和石杉碱甲(0.1 mg/kg)组,每组15只。Model组及给药组每日颈背部皮下注射D-半乳糖(100 mg/kg),Control组颈背部皮下注射等体积生理盐水,连续灌胃给药8周。第9周后进行自主活动、Morrris水迷宫和避暗实验观测小鼠行为变化;通过血清内SOD、MDA、GSH-Px、T-AOC和脑内AGEs水平来判断小鼠氧化应激的损伤程度;通过脑内Ach含量和AChE水平检测小鼠胆碱能系统受损伤程度;采用脑内NO、IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的分泌水平来评价炎症反应程度。结果研究发现,与Control组小鼠相比,Model组小鼠自主活动能力并未受到影响。与模型组小鼠相比,Cornuside能明显改善模型小鼠的空间记忆能力及记忆再现能力,表现为给药后小鼠寻找平台时间缩短和搜索次数增加,躲避电击能力增强;其次还能够升高给药组小鼠血清内SOD、T-AOC和GSH-Px水平,降低MDA含量,同时能够显著减少海马和大脑皮层AGEs含量;Cornuside还能够作用于胆碱能系统,抑制脑内AChE的表达;最后我们检测到脑组织内NO、IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子分泌减少。以上指标与Model组相比均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),在剂量为12.5 mg/kg条件下效果最为显著。第三部分山茱萸新苷改善D-半乳糖致学习记忆障碍模型小鼠的体内机制探讨目的探讨中药山茱萸中化合物Cornuside对D-半乳糖致学习记忆障碍模型小鼠的初步作用机制。方法采用2月龄雄性昆明小鼠,按体重随机分为Control、Model、Cornuside(3,12.5,50 mg/kg)组、阳性药多奈哌齐(1 mg/kg)和石杉碱甲(0.1 mg/kg)组,每组15只。Model组及给药组每日颈背部皮下注射D-半乳糖(100 mg/kg),Control组颈背部皮下注射等体积生理盐水,灌胃给药8周后采用HE和尼氏染色的方法检测Cornuside对D-Gal引起的小鼠海马CA1和CA3区神经元丢失的影响;免疫组化方法检测小鼠大脑皮层RAGE和BDNF以及海马区GFAP和Iba1的表达量;利用Western blot考察经典炎症信号通路AP-1和NF-κB中关键蛋白IκBα、JNK、ERK1/2和p38的表达量及其磷酸化水平的变化。最后利用Western blot筛选出靶蛋白,运用分子对接的方法再次进行靶点的验证。结果HE染色和尼氏染色结果表明Cornuside能够明显增加脑损伤小鼠海马CA1、CA3区神经元和尼氏小体的数量,免疫组化的结果发现Cornuside能增加大脑皮层BDNF的表达量,降低RAGE和Iba 1的表达量,同时能够降低海马CA1和CA3区GFAP的表达量。神经元的损伤受神经炎症调控,于是我们利用Western blot方法对经典的炎症信号通路AP-1和NF-κB进行逐一排查。结果发现Cornuside能够抑制AP-1信号通路中ERK1/2和NF-κB信号通路的IκBα的磷酸化,进而减少相关炎症因子的分泌,而对AP-1信号通路中的JNK和p38的磷酸化无明显抑制作用。随后运用分子对接技术对IκBα和ERK1/2进行靶点验证,结果显示Cornuside与IκBα结合较弱,而与ERK1/2结合较强。通过以上研究,本论文可以得到以下初步结论:1.Cornuside在不影响正常SH-SY5Y细胞活力的浓度下,对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有较好的保护作用,这可能与其降低细胞氧化损伤,抑制细胞凋亡相关。2.Cornuside对D-Gal所致学习记忆障碍小鼠的学习记忆功能有明显的改善作用,这种作用可能是通过降低认知障碍小鼠体内氧化应激状态及炎症因子表达水平来实现的。3.Cornuside的神经保护作用可能是通过调节AGEs-RAGE-IκBα-ERK1/2信号通路实现的,并能改善蛋白的异常磷酸化状态,而其中起到关键作用的蛋白可能是 ERK1/2。综上所述:本研究采用H2O2损伤SH-SY5Y神经细胞模型和D-Gal致小鼠学习记忆障碍模型,分别从体内和体外两方面考察了 Cornuside的神经保护作用,分析和明确了不同剂量之间的差异,为进一步深入研究奠定了基础。首次证实,山茱萸环烯醚萜苷类成分Cornuside具有很好的抗氧化损伤、抗神经炎症和抗神经细胞凋亡作用,进而发挥改善认知障碍的多重保护作用,而这种作用很可能是通过调节AGEs-RAGE-IκBα-ERK1/2信号通路实现的,以上实验结果为Cornuside防治AD提供了直接实验依据。这样的结果也提示富含Cornuside的药材或食品具有被用于治疗氧化应激和炎症等相关疾病的潜在能力。此外,本研究确定了 ERK可能为Cornuside发挥药理作用的靶点之一,这也提示Cornuside在ERK信号通路参与的其他疾病中可能具有潜在的研究价值。