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近几十年来,病原菌耐药性伴随着抗生素的过度使用与滥用日益增长,严重威胁着人类的健康。及时而准确地提供病原菌药敏结果对于正确给药、控制病原菌耐药以及挽救病人生命具有重要的意义。传统的药敏测试方法通常是基于表型的培养方法,耗时长且工作量大。分子相关的药敏测试技术可以快速给出药敏结果,但是这种技术仅仅局限于已知耐药机制的抗生素药敏测试。本论文为了克服目前药敏检测方法中的不足,结合分子检测技术的发展,建立了三种不同的快速药敏检测新方法。本研究的第一部分通过普通PCR仪进行细菌的孵育与核酸提取,利用海藻糖作为保护剂,发展了一种可在室温稳定储存的冷冻干燥的16S rDNA qPCR试剂,建立了一种高通量的抗生素药敏检测方法。该方法中将荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)与传统的培养方法进行结合,通过通用引物以细菌16S rDNA为靶标检测细菌与抗生素共同孵育的过程中核酸拷贝数目变化的药敏测试方法,可以快速且广谱地进行药敏测试,且克服了传统培养方法耗时长,以及分子方法局限于已知耐药机制的缺陷。该方法通过反复加热与冷冻裂解细菌的核酸提取方法克服了商业化核酸提取试剂盒或苯酚-氯仿核酸提取方法中存在多个转移步骤,增加测试时间且增加可能出现的污染以及潜在的生物安全隐患。该方法利用冷冻干燥技术储存样品,克服了常规qPCR检测中的DNA聚合酶需要冷冻运输与保存,降低了检测成本,且扩大了此方法在资源匮乏地区的使用。我们将这种培养与qPCR相结合的方法应用于对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌临床分离株的药敏测试,结果显示,在4小时以内,药敏测试一致性可分别达到97.22%(95%CI,85.83-99.51)和96.43%(95%CI,79.76-99.81)。这种方法通过两块96孔板在4小时内完成12个样本7种抗生素的药敏测试,显著提高了目前培养-qPCR方法药敏检测的效率。本研究的第二部分利用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)可以生成纳米级微滴的特点建立一种新的单菌双重微滴数字PCR快速筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法:通过微滴生成将细菌分散至纳米级微滴;然后对于每一个微滴当中的细菌进行nuc和mecA双靶标的扩增;最终通过分析nuc和mecA双阳性微滴所占的比例实现待测样本中MRSA的筛查。这种方法不仅可以克服传统的培养方法耗时长的缺陷,也可以克服因为“mecA dropout”菌株的出现导致检测针对mecA基因盒框架与orfX基因链接区域MREJ为靶标以及甲氧西林敏感性细菌和耐甲氧西林葡萄球菌的存在而导致检测金黄色葡萄球菌特异性基因和耐甲氧西林特异性基因mecA的双重qPCR检测过程中出现的假阳性问题。整个检测过程不需要细菌的分离纯化,细菌的核酸释放通过本实验室构建的金黄色葡萄球菌嵌合裂解酶ClyH进行裂解。这种方法在存在大量非目标菌的鼻拭子模拟样本中检测MRSA的极限为2900 CFU/mL。104份鼻拭子样本的MRSA筛查结果与传统的培养方法结果符合率为100%。结果表明这种单菌微滴双重数字PCR可以在4小时实现临床样本中MRSA准确而快速地筛查。本论文的第三部分主要在第一部分和第二部分的研究基础上,利用微滴数字PCR结合培养的方法建立了一种直接从痰液中快速鉴定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)和多重耐药结核分枝杆菌(Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-TB)的新方法(培养-ddPCR)。对39份痰涂片阳性样本,ddPCR检测的阳性结果与MGIT 960培养方法的阳性结果显示的一致性为100%(95%CI=86.66%to 100%)。对32份最终筛查的阳性样本药敏测试,培养-ddPCR与琼脂比例方法对于利福平、异烟肼和链霉素检测的一致性分别为87.5%(95%CI=71.93%to 95.03%)、84.38%(95%CI=68.25%to 93.14%)和96.88%(95%CI=84.26%to 99.45%)。结果表明培养-ddPCR方法可在4天以内完成MTB和MDR-TB的检测,极大地缩短了目前结核菌鉴定与药敏测试的时间。三种新的基于核酸检测病原菌药敏测试方法的建立极大的缩短了目前药敏测试的时间,可以实现高通量药敏测试,不过其临床应用前景仍然需要未来通过大量样本的检测来评估。