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非可再生化石资源的大量消耗导致了严重的环境问题和生存压力,开发清洁的可再生资源已成为能源领域的一个迫在眉睫的课题。研究者普遍认为生物质是唯一可以替代化石资源获取燃料、化学品和材料等的可再生资源,极具发展前景。其中,微藻具有将废弃物转化成生物燃料、食品、饲料原料以及其它高附加值生化产品的巨大潜能。微藻作为多不饱和脂肪酸(PUFAs)的初级生产者,其种类繁多、蕴藏量大并且富产多种高附加值的生物活性物质;特别是近年来微藻已成为人们获取花生四烯酸(Arachidonicacid,ARA)的重要来源。与传统的动物来源和微生物发酵等获取ARA的方法相比,利用微藻生产ARA具有生产成本低、含量相对较高、提取效率高、藻种不易退化、微藻储备量巨大,弥补动植物资源紧缺等明显优势。同时,紫球藻富含藻红蛋白、油脂、维生素、色素以及胞外多糖,尤其是富含长链不饱和脂肪酸,包括占总脂肪酸含量高达36%的ARA及17%的EPA。本论文以厦门大学筛选得到的富含ARA的紫球藻(Porphyridium purpureum CoE1)为研究对象,利用人工海水ASW培养基,通过扩大培养条件的优化以及关键因子的调控,使细胞快速生长获得高生物量,并提高ARA等目标产物的含量,进而大大提高ARA和总脂肪酸的产量。首先,通过20 L规模扩大培养的主要环境条件和工程学问题的研究,发现培养温度、光照强度、渗透压、起泡现象是影响扩大培养的主要因素。培养温度过高(本实验条件下超过35 ℃)藻细胞出现高温不适应现象(细胞变形、破裂等)甚至死亡;培养温度太低,紫球藻代谢不够旺盛,生物量和代谢产物积累过少,产量不高;适宜温度范围内(25～35 ℃),培养温度越高,紫球藻生长越良好,生物量和脂肪酸等代谢产物积累丰富,从而选定35 ℃作为最优培养温度。光照强度过高会导致紫球藻细胞出现光抑制现象甚至细胞形态改变或死亡;光照强度太低藻细胞虽然可以维持基本生存,但生物量和代谢产物积累过少;在适宜的光照强度(165 μmol/m2s)和最优培养温度35℃下,紫球藻生长旺盛,生物量和脂肪酸等累积丰富。鉴于紫球藻细胞没有细胞壁而由分泌到细胞外的粘多糖形成粘质壳作为保护,因此细胞对渗透压和剪切引力比较敏感,把培养规模降低到20 L以减小细胞收到的渗透压,同时利用沙头分散气泡替代底部直接通气以降低细胞受到的剪切应力。由于泡沫现象使藻体细胞漂浮在液面或悬浮在气泡上,引起藻细胞的死亡,从而降低生物量,因此,采用消泡剂有效遏制了泡沫现象而间接提高生物量。通过上述条件的调控,紫球藻在165 μmol/m2s光照强度、35 ℃培养温度下,生物量可高达3.40g/L,总油脂最高含量为17.41%,总脂肪酸含量高达 48.44 mg/g、ARA 最高含量为 11.53 mg/g、UFAs/TFAs 最高为 47.60%。其次,探究了 50L培养规模下,通过光照强度梯度(70、165、280 μmol/m2s)和温度梯度(25、30、35 ℃)两个主要单一变量因子实验,找出最有利于紫球藻生长和脂肪酸(主要是ARA)积累的条件;并通过补充充足碳源NaHC03和限制磷源KH2PO4两个主要营养因子调控紫球藻生物量积累和脂肪酸合成。研究结果表明,紫球藻在50LASW培养基中,300 L/min通气量、280 μmol/m2s的光照强度、35℃培养温度条件下培养生长迅速,生物量可高达6.50g/L;并且在该培养条件下,培养至稳定期,藻细胞生产的总脂肪酸含量最多为56.01 mg/g、产率为350.35 mg/g;在接近稳定期时收获的ARA含量最高为20.29 mg/g。而EPA却在280 μmol/m2s的光照强度、25 ℃条件下获得最高含量7.00 mg/g,同时该条件下UFAs/TFAs最高为74.66%,普遍高于其它培养条件。说明适当提高光照和温度有利于紫球藻生物量合成和脂肪酸,尤其是ARA的积累。高光照280 μmol/m2s条件下,ARA/EPA随培养温度升高而升高,在35 ℃时到达最高5。因此推断,高培养温度有利于ARA的积累而抑制EPA的合成。在高光照280 μmol/m2s、35 ℃培养温度条件下,补充充足的碳源NaHCO3,有利于紫球藻的生长和脂肪酸(主要是饱和脂肪酸)的积累;在充足碳源0.8 g/L NaHCO3和限制磷源0.035g/L KH2PO4营养条件下,紫球藻的最高生物量为6.84g/L、棕榈酸的含量高达23.24 mg/g、ARA的含量基本无明显增长而维持在20.86 mg/g;在正常碳源和磷限制(0.035 g/LKH2PO4)条件下生物量却只有4.76g/L,ARA的含量仍维持在20.32 mg/g。但值得一提的是磷限制条件下油脂含量与对照组相比明显提升,最高可达18.40%,说明磷限制有利于油脂的积累。同时通过对1L摇瓶和50 L扩大培养获得的藻细胞中主要脂肪酸含量的对比分析,发现扩大培养促进了 C16向C18再向C20的转化,尤其是C16:0向C18和C18:2向ARA的转化,从而使扩大培养获得更高含量的ARA,结合ARA和EPA合成路径,推测扩大培养促进了A5、△6去饱和酶表达而抑制A17去饱和酶的活性。最后,利用尿素包埋法和精馏法分离法纯化ARA。尿素包埋法的最佳条件为:尿素脂肪酸甲酯比为4:1(w/w)、乙醇脂肪酸甲酯比为12:1(v/w)、包埋时间为12 h、包埋温度为-15 ℃,在此条件下获得的ARA纯度最高可达约94.97%,一般可达80%～90%。精馏法的最佳分离条件:压力600 Pa、加热温度235 ℃、油样温度232 ℃、精馏塔柱温232 ℃、回流比8:2,在该条件下分离得到的ARA纯度高达95.37%。两种方法在ARA纯度上几乎没有差异。经过两种方法对比,采用精馏法可以去除色素,得到澄清透明的ARA油样;从经济可行性考虑,明显低能耗的尿素包埋法更可行;从油脂回收率考虑,精馏法具有明显优势。