背景和目的高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）技术是一种新兴的临床非侵入性治疗技术，与组织的作用包括热效应，机械效应和空化效应，凭借着持续声能量沉积导致靶区组织的热消融，而达到治疗的目的。近年来，已用于多种肿瘤的治疗。目前，连续HIFU（continuous high intensity focused ultrasound，cHIFU）用于肿瘤的一次性消融，以高热效应为主，但是高功率、长时间的治疗会导致一些并发症，如皮肤灼伤、胃肠道穿孔等。脉冲HIFU（pulsed high intensityfocused ultrasound，pHIFU），不同以往的连续波式HIFU辐照方式，其所致生物学效应取决于其声功率、工作周期（占空比）、脉冲重复频率、辐照时间和深度等多个参数。pHIFU采用间歇性的能量投放方式，避免长时间连续HIFU辐照，或可达到提高HIFU治疗效率，减少并发症发生。另外，离体器官灌注模拟了器官在活体内的功能，但又不受活体软组织复杂声通道及呼吸等干扰，因此选择灌注离体猪肝作为本实验的研究对象。在建立灌注离体猪肝模型的基础上，实验首先分别对灌住组和非灌注组进行pHIFU辐照，探讨肝脏灌流对pHIFU辐照致热沉积的影响，然后进行不同占空比和辐照时间pHIFU辐照，从组织损伤效果、声像图表现、温升情况及空化信号来研究其与cHIFU之间的差异，为pHIFU的研究提供实验基础，为临床HIFU应用提供新的思路和依据。材料与方法1.离体再灌注肝脏模型建立离体猪肝再灌注模型建立[1-2]：取屠宰后即刻的新鲜整副猪肝（包留完整的肝动脉、门静脉、肝静脉、胆囊、胆囊管），将肝素与生理盐水以1:100的比例配制40ml，混合于2000ml乳酸钠林格注射液用于冲洗门静脉、肝动脉，使血管通畅无阻塞，然后浸泡于乳酸钠林格液中，保持温度为4℃待用。2小时内送入实验室后，结扎胆囊管，引流胆总管，对肝动脉、门静脉进行插管连接于循环泵，打开氧和器，氧流量保持5L/min，调整循环泵各血管流量，肝动脉以18ml/min/kg、门静脉以40ml/min/kg建立肝动脉、门静脉、肝静脉的循环。观察肝脏形态学、超声影像学表现，记录灌注前后血流动力学、生化参数和组织结构学变化。2.脉冲高强度聚焦超声辐照离体灌注肝脏2.1肝脏灌流对脉冲高强度聚焦超声辐照致热沉积的影响整个辐照过程保持各个血管循环通畅为再灌注组，循环建立后关闭各个血管进行辐照则为非再灌注组。固定辐照功率为80W，脉冲重复频率为100Hz，辐照深度为20mm。选择占空比30%、20%、10%，辐照时间20s，采用定点辐照方式。每占空比-时间参数分别在两组里重复实验20次，共120个辐照点。辐照中使用热电偶测取靶区温度，并通过数据读取程序进行记录。辐照后即刻采集B超声像图，同辐照前同一位置的声像图进行比较。辐照结束后，将猪肝切成厚为1~2mm的薄片，找出最大损伤所在层面，拍照后使用Jupiter软件测量猪肝实际坏死体积。2.2灌注条件下脉冲高强度聚焦超声与连续波高强度聚焦超声的对比性研究在离体猪肝再灌注模型基础上，选择辐照功率80W，辐照深度20mm，脉冲重复频率100Hz，使用不同占空比（分别为100%、30%、20%、10%）进行定点辐照。占空比为100%时即为连续波，辐照时间为4s，其他占空比下辐照时间为（4、8、12、16、20）s，每占空比-时间组均辐照20个点，共320个辐照点。采集辐照前及HIFU辐照后各个时间点靶区二维声像图，然后作图像后处理，测量出灰度增强值；采集辐照过程中的被动空化信号；热电偶探针测焦域中心温度。辐照结束后，将猪肝组织以1~2mm厚度切开，对损伤最大面数码拍照，使用Jupiter软件测量猪肝实际坏死面积，显示最大截面，测量最大损伤径线,数码照相后软件测生物学焦域面积，取正常组织与坏死组织交界区域组织送病理检查。结果1、12例猪肝灌注后4h后，肝脏表面颜色均匀红润、质地柔软；血流动力学和肝脏功能稳定：门静脉和肝动脉流速为13.9±1.7cm/s、38.9±2.2cm/s；平均压力分别为9.05±1.4mmHg、112.6±10.6mmHg；胆汁和ALT酶分泌稳定；猪肝较灌注前稍增重；在光镜下，灌注猪肝组织的小叶结构完整，随时间延长，部分细胞肿胀及肝窦增宽。2、占空比-时间参数为10%-20s、20%-20s、30%-20s，灌注组与非灌注组每个辐照点均出现凝固性坏死和强回声。在灌注下，靶区坏死面积分别为19.23±1.33cm~2、28.39±1.28cm~2、35.87±1.40cm~2；B超声像图回声增强面积分别为13.82±1.22mm~2、21.48±1.04mm~2、27.41±1.42mm~2；灰度增加值分别为49.3±11.78、82.3±17.14、103.6±15.17；辐照中焦域处的最高温度分别为46.54±0.43℃、56.68±1.16℃、61.21±1.50℃。在非灌注下，靶区坏死面积分别为23.61±1.31mm~2、35.76±1.18mm~2、41.45±1.32mm~2；B超声像图回声增强面积分别为19.28±1.42mm~2、27.40±1.71mm~2、35.98±1.77mm~2，灰度增加值分别为56.08±15.1、90.04±14.84、106.44±18.57；辐照中焦域处的最高温度分别为50.38±0.49℃、66.23±1.58℃、71.54±1.61℃。3、占空比-时间参数为30%-8s、20%-12s、10%-20s、100%-4s所致靶区坏死面积分别为20.39±1.26mm~2、19.59±1.26mm~2、19.23±1.33mm~2、20.50±1.61mm~2，差异无统计学意义（P>0.05）。4、相同时间下，在一定范围，脉冲式HIFU随着占空比增大，所致靶区坏死面积也增加；在占空比为30%、20%下，靶区坏死面积随时间的延长而增大，但参数为10%-8s与参数为10%-12s所致靶区坏死面积分别为10.31±1.19mm~2、14.38±1.57mm~2，差异无统计学意义（P>0.05）。5、占空比-时间参数为30%-4s、20%-4s、10%-4s靶区回声增强灰度值分别为59.15±18.99、47.77±14.12、30.00±14.73，存在显著差异（p<0.05）；每个占空比下，辐照时间8s出现回声增强灰度值明显大于辐照时间4s的回声增强灰度值，辐照时间≥8s，同占空比下引起回声增强灰度值随占空比增大而无明显增大，并且占空比20%与30%之间也无差异（p>0.05），10%与其他两组灰度值具有显著差异（p<0.05）。6、占空比为30%、20%、10%下靶区产生的强回声面积随着时间的延长存在增大现象，但是参数为10%-8s、10%-12s、10%-16s下，靶区强回声面积无明显差异（P>0.05）。7、pHIFU各占空比下（10%、20%、30%），其平均最高温度分别为46.54±0.43℃、56.68±1.16℃、61.21±1.50℃，cHIFU辐照4s致靶区组织平均最高温度可达63.36±1.22℃。8、占空比-时间参数为100%-4s、10%-20s、20%-20s、30%-20s，HIFU辐照时的平均最大RMS值分别为1.52±0.69mv、1.49±0.8mv、1.46±0.76mv、1.50±0.58mv，差异无统计学意义（p>0.05）。结论1、离体灌注猪肝的形态学、超声影像学及组织学表现未见明显异常，肝脏的功能和血流动力学稳定，能够模拟活体肝脏血液循环，表明满足高强度聚焦超声实验研究的体外猪肝灌注模型建立成功；2、在相同占空比-时间参数下，非灌注组所致靶区坏死的面积、回声增强区域面积和平均最高温度均大于灌注组，差异具有显著性（p<0.05）；而灰度增加值无明显差异（p>0.05）；3、cHIFU与pHIFU辐照再灌住猪肝致相同损伤大小的情况下，前者比后者所需剂量较大；pHIFU所致的平均最高温度小于cHIFU所致的平均最高温度，且温升速度较cHIFU的慢。4、每个占空比，pHIFU辐照再灌注猪肝所致靶区坏死面积、回声增强区域面积、平均最高温度均随着时间的增加而增大。相同时间下，靶区坏死面积、回声增强区域面积、平均最高温度都随占空比增大而增大。5、辐照时间为4s，声像图回声增强灰度值随占空比增大而增大，差异具有显著性（p<0.05）；辐照时间≥8s，占空比20%与30%之间回声增强灰度值差异不显著，10%与其他两组灰度值均有显著差异。每个占空比下，辐照时间在8s以内回声增强灰度值呈增大趋势，8s以后回声增强灰度值增大不明显，近似趋于饱和。6、声功率为80w时，无论是连续波还是占空比为10%、20%、30%的脉冲波辐照灌注猪肝，均无明显空化发生。