猪圆环病毒病（porcine circovirus associated disease,PCVAD）指由猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）引起的相关疾病。5-18周龄仔猪易感,感染猪群常出现进行性体重减轻、发育迟缓、黄疸、淋巴结肿大等临床症状,圆环病毒感染仔猪会造成免疫抑制,除主要引起断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）外,还会引起猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS）、猪呼吸系统疾病、先天性震颤、繁殖障碍综合征、胎儿心肌炎和生殖衰竭等多种疾病。该病自1974年被发现以来,已在全世界范围内广泛流行,给世界养猪业造成了严重的经济损失。Cap蛋白作为猪圆环病毒II型（PCV2）的主要结构蛋白,其含有病毒的主要抗原表位,并且具有良好的免疫原性,可刺激猪只产生中和抗体。纳米抗体（Nanobody,Nb）是存在于骆驼科动物体内的一种天然缺失轻链和重链第一恒定区（CH1）的特殊Ig G,分子质量小,相对于哺乳动物的传统Ig G,其具有结构稳定、易于基因工程改造和生产成本低等优点。基于上述优点,纳米抗体已在不同传染病的诊断技术研发中得到了广泛应用,并且表现出高敏感性、高特异性以及低生产成本等特点,具有很好的市场应用前景。本研究用可溶性的PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼,利用噬菌体展示技术筛选和制备了该蛋白的特异性纳米抗体,并基于融合表达HRP的纳米抗体建立了一种快速检测PCV2抗体水平的竞争ELISA方法。本研究的主要内容和结果如下:1.纯化了骆驼血清Ig G,免疫成年家兔获得了兔抗骆驼Ig G抗血清,为纳米抗体制备中相关抗体效价的检测提供了材料。2.利用纯化的Cap蛋白作为免疫原,免疫成年雄性双峰驼,4次免疫后,血清中Cap蛋白特异性抗体效价达1:1,024,000;最后一次免疫后一周,分离双峰驼外周血淋巴细胞,通过巢式RT-PCR、酶切、连接和转化,构建获得了库容为5×106且多样性丰富的VHH噬菌体展示文库;然后利用Cap重组蛋白为筛选抗原,经过3轮筛淘获得19株Cap蛋白特异性纳米抗体。3.将筛选到的纳米抗体融合HRP进行真核表达,为基于纳米抗体的快速竞争ELISA检测方法的建立提供材料。4.建立并优化了快速检测PCV2抗体的竞争ELISA方法。优化后确定抗原最佳包被浓度为1μg/m L,纳米抗体最佳稀释度为1:400,血清稀释比为1:10,反应时间为37℃作用30 min;用PCV2阳性血清和阴性血清评价该方法的敏感性和特异性,敏感性和特异性分别达99.1%和100%;通过板内板间重复试验评价重复性,板内PI值的变异系数在1.3%7.4%,板间PI值的变异系数在3%7.23%,表明该方法重复性良好;比较该方法检测结果与商品化试剂盒的一致性,符合率达99.2%;与其它病毒阳性血清的交叉反应试验结果表明,用该方法检测其它阳性血清无交叉反应。综上所述,本研究筛选制备了抗PCV2 Cap蛋白的特异性纳米抗体,并获得了真核表达的融合HRP的抗Cap蛋白纳米抗体,利用该纳米抗体建立了检测PCV2抗体的竞争ELISA检测方法。该方法省去了HRP标记二抗的使用,缩短了检测时间、简化了操作,可用于PCV2抗体水平的快速检测。