动脉粥样硬化性疾病严重危害人类的健康,血管重塑和斑块稳定性转变机制一直是研究的热点和关注的中心。研究发现生物钟基因与心血管系统的功能有密切关系。生物钟是参与调控机体各项行为生理活动的系统,以近24小时为周期呈节律性振荡。生物钟系统包括中枢生物钟系统和外周生物钟系统。中枢生物钟系统位于下丘脑的视交叉上核神经元中,并通过神经、体液等信号调控外周生物钟系统。近年来的研究表明,外周组织和细胞同样拥有一个和中枢相似的相对独立的生物钟系统。主要的生物钟基因包括：Bmall, Clock, Per, Cry, Rev-erba等,他们之间互相作用形成一个转录-翻译反馈环路,从而协调钟基因及下游钟控基因的节律性表达。通过对钟控基因的调控,生物钟基因参与到一些心血管疾病高危因素的调节,如代谢紊乱、炎症、凝血异常等。在多种心血管疾病过程中,研究均发现钟基因的表达节律发生改变。这提示生物钟基因及其下游信号转导通路可能在斑块形成及稳定性转变过程中发挥了重要作用。研究表明：钟基因参与调控细胞增殖和凋亡；钟基因敲除小鼠易形成高脂血症和肥胖综合征；钟基因敲除小鼠血管发生病理性重塑,血管老化,血管舒张反应减弱,促炎因子表达增加,舒血管因子合成减少,促进动脉粥样硬化的发生；钟基因突变小鼠体内凝血功能发生改变,纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)表达幅度和节律均出现混乱,可导致动脉粥样硬化血栓形成。本课题组前期实验发现,apoE基因敲除的小鼠动脉粥样硬化模型,心血管系统钟基因(Per2、Bmall)表达节律发生改变。同时还发现,该小鼠的凋亡相关基因(c-myc和p53等)和纤溶系统相关基因(PAI-1和t-PA)的表达节律发生了混乱。但是,目前国内外在此方面的研究主要集中于动物实验。本课题在前期工作的基础上,直接针对人类颈动脉粥样硬化病变进行研究。构建了改良植块法体外培养颈动脉斑块来源及正常颈动脉来源的血管平滑肌细胞(VSMCs)模型。对斑块来源VSMCs的理化及形态学性质进行了细致研究。同时,我们采用血清休克法诱导VSMCs的昼夜节律,来观察生物钟基因的节律性表达情况,并探讨生物钟基因在动脉粥样硬化斑块形成和发展过程中起的作用。最后,我们还检测了斑块来源的VSMCs和正常颈动脉来源的VSMCs中,与斑块稳定性相关的凋亡相关基因和纤溶系统相关基因表达节律,以期发现下游钟控基因表达节律改变在斑块易损性转变过程中所起的作用。第一部分：人颈动脉粥样硬化斑块来源血管平滑肌细胞中生物钟基因表达的变化目的：建立人颈动脉粥样硬化斑块来源的血管平滑肌细胞原代培养模型,观察颈动脉斑块来源的血管平滑肌细胞模型的理化及形态学特性。检测斑块来源血管平滑肌细胞中生物钟基因表达的改变,并探讨其机制。方法：采用改良植块法体外培养颈动脉斑块来源及正常颈动脉来源VSMCs模型。其中斑块标本源自2012年5月到2013年7月间在中山医院血管外科行颈动脉内膜剥脱术的患者,共计56例。正常颈动脉标本采集自心脏移植供体(健康志愿捐献者)血管,共10例。采用倒置相差显微镜、免疫荧光染色、油红O染色及透射电子显微镜观察细胞形态和理化特性。通过血清休克法诱导细胞生物钟基因的节律性表达。将血清休克开始的时间定义为Zeitgeber time 0 (ZTO),分别在ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16和ZT20等6个时间点收集细胞,提取RNA,采用Real-TimePCR检测不同来源VSMCs中生物钟基因(Bmall,Clock, Cryl, Cry2, Per1, Per2, Per3和Rev-erba)在mRNA水平表达量及表达节律的变化。结果：56例斑块标本中,21例成功培养出足够的VSMCs。在10例正常对照中有7例培养出VSMCs。植块7-12天后,细胞开始呈放射状从植块边缘迁移出来,培养约4周后细胞形成典型的“峰-谷样”结构,可以进行传代培养。正常颈动脉来源的VSMCs为典型的长梭形,而斑块来源的VSMCs分化为两种差异较大的细胞形态：长梭形和大而扁平的不规则星形,同时两种形态的细胞均表达血管平滑肌细胞的标志物α-SMA。但是,油红O染色结果发现：不规则星形细胞的脂质含量要明显高于长梭形细胞；同时,透射电镜观察细胞超微结构提示：长梭形细胞内可见典型的肌丝结构和致密体,而不规则星形细胞内则含有大量的粗面内质网和脂滴空泡。据此推断,斑块来源的血管平滑肌细胞其表型发生了转变,分化为两种细胞表型：收缩型(长梭形细胞)和合成型(不规则星形细胞)。血清休克后,正常颈动脉来源VSMCs和斑块来源VSMCs的生物钟基因Bmall,Cry1,Cry2, Per1, Per2, Per3, Rev-erbα在nRNA水平均呈24h节律性表达,Clock mRNA在斑块来源VSMCs中呈节律性表达而在正常颈动脉来源VSMCs无明显节律性。但是,与正常颈动脉来源VSMCs^目比,斑块来源VSMCs的核心生物钟基因振荡幅度在mRNA水平显著减弱；且BMAL1的24h节律性亦发生改变,峰值相位从ZT16前移到了ZT12。在校正了年龄因素后,对两组细胞进行亚组分析,发现结果仍一致。第二部分：斑块来源血管平滑肌细胞中凋亡及纤溶系统相关基因改变的研究目的：检测斑块来源血管平滑肌细胞中凋亡及纤溶系统相关基因表达的改变,探索生物钟基因调控下游钟控基因的潜在通路,并探讨其机制。方法：通过血清休克法诱导细胞生物钟基因的节律性表达。将血清休克开始的时间定义为Zeitgeber time 0 (ZTO),分别在ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16和ZT20等6个时间点收集细胞,提取RNA,采用Real-Time PCR检测不同来源VSMCs中凋亡相关基因(Fas, p53和Bax)及纤溶系统相关基因(PAI-1和t-PA)等在mRNA水平表达量及表达节律的变化。结果：血清休克后,正常颈动脉来源VSMCs中与斑块稳定性有关的凋亡相关基因(Fas和P53)和纤溶相关基因(PAI-1和t-PA)呈昼夜节律性表达,而在斑块来源VSMCs中除t-PA外其余相关基因的表达节律均发生紊乱,失去了统一的节律性。且与正常颈动脉来源VSMCs相比,在斑块来源VSMCs中PAI-1表达水平升高,而t-PA振荡幅度则减低且峰值相位前移至ZT12。结论：采用改良植块法体外培养颈动脉斑块来源及正常颈动脉来源VSMCs模型。与正常颈动脉来源VSMCs相比,颈动脉斑块来源VSMCs表型发生了转变,分化为两种细胞表型：收缩型和合成型。通过血清休克法诱导VSMCs生物钟基因昼夜节律性表达模型。与正常颈动脉来源VSMCs相比,颈动脉斑块来源VSMCs其核心生物钟基因振荡幅度明显减弱,节律发生改变；其下游与斑块稳定性有关的凋亡和纤溶相关基因表达节律均发生紊乱。这些改变,可能参与了动脉粥样硬化斑块的形成,并引发稳定斑块向不稳定斑块发展,最终导致斑块破裂。相关的调控机制还有待进一步研究。