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Genistein是一种来源于豆类植物的异黄酮类化合物,结构与雌二醇相似,主要与ER-β结合,介导雌激素样作用,而ER与甲状腺癌的发生具有重要关系。同时,Genistein还是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂,可抑制酪氨酸蛋白激酶TPK活性,导致癌细胞增殖受到抑制。临床上,Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂应用在非小细胞肺癌、前列腺癌中,但是在甲状腺癌中的作用鲜少报道。本研究通过不同浓度Genistein处理具有不同基因背景的甲状腺癌细胞,探讨Genistein对甲状腺癌细胞,尤其是高危甲状腺癌细胞的增殖及上皮间质转化(EMT)的作用,为高危甲状腺癌的辅助治疗提供实验基础和理论依据。第一部分Genistein在含有不同基因背景的甲状腺癌细胞增殖中的研究方法1.培养人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1及含有不同基因背景的甲状腺癌细胞BHP10-3(甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC), RET/PTC 1 rearrangement), BCPAP(PTC, BRAFv600Emutation), IHH4(PTC, BRAFv600Emutation), TT2609 (甲状腺髓样癌 (medullarythyroid carcinoma), MTC)。2.不同浓度(0,1%DMSO,2.5 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml,20 μg/ml,40 μ g/ml,80 μg/ml)不同时间段(24h,48h,72h) Genistein处理甲状腺癌细胞,以1%DMSO处理组作为对照,MTS检测处理后细胞增殖情况。3.根据MTS结果,选取与3个时间段IC50值接近的值(0,5μg/ml,10 μg/ml,20μg/ml,40μg/ml)作为后续试验浓度,首先镜下观察不同浓度处理后细胞形态变化,然后分别用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,以及实时定量荧光PCR技术(RT-qPCR)、Western Blot检测细胞周期蛋白的表达情况。结果1.MTS检测结果表明：Genistein邕够有效抑制甲状腺癌细胞的增殖,其中含有BRAFV600E突变的BCPAP和IHH4细胞株以及含有RET/PTC1重组的BHP10-3抑制率最高,达95-9996,而甲状腺髓样癌细胞的抑制率最高仅77%。同时Genistein也能够抑制正常甲状腺滤泡上皮细胞的增殖,最高可达73%。所有细胞的MTS结果均呈明显的时间依赖性和浓度依赖性。2.梯度浓度Genistein处理正常甲状腺滤泡上皮细胞及所有癌细胞后,镜下观察细胞形态变化发现：正常细胞形态变化不明显,细胞没有出现明显死亡现象；而各癌细胞株形态发生了明显变化。其中细胞形态未经任何处理为梭形的癌细胞BHPI0-3的体积逐渐变小,细胞突起回缩,细胞变圆变亮,细胞仅增殖受到抑制,并没有出现明显的细胞死亡；而最初为圆形的癌细胞BCPAP,IHH4体积逐渐增大,细胞处于崩解状态,出现明显的细胞死亡；最初为圆形的癌细胞TT2609细胞呈现明显的梭形改变,细胞突起逐渐增长,呈网状改变,并出现明显的细胞死亡。3.流式细胞术检测细胞凋亡结果表明：Genistein能够诱导甲状腺癌细胞的凋亡,而正常甲状腺滤泡上皮细胞没有出现明显的凋亡。其中含有RET/PTC1重组的BHP10-3细胞凋亡最高仅7.1%,含有BRApV600E突变的BCPAP高达25.3%,IHH4高达29.6%；甲状腺髓样癌细胞TT2609高达20.9%。4.流式细胞术检查细胞周期表明：正常甲状腺滤泡上皮细胞及所有癌细胞周期均被阻滞在G2/M期,Genistein处理后正常细胞G2/M期升高约4倍,IHH4和BCPAP升高10倍、13倍,而BHP10-3和TT2609升高约8倍,具有明显的统计学意义；正常细胞Nthy-ori 3-1的S期升高,其他癌细胞S期均降低,但都无统计学意义。5. RT-qPCR和Western Blot结果表明：所有癌细胞株的周期蛋白CyclinA2, CyclinBl降低,CyclinDl升高；而正常甲状腺滤泡上皮细胞上述三种周期蛋白均下降。结论1. Genistein抑制甲状腺癌细胞增殖,呈明显的时间依赖性和浓度依赖性。2. Genistein通过调控细胞周期蛋白CyclinA2, CyclinBl, CyclinDl将细胞周期阻滞在G2/M期,引起细胞凋亡,从而抑制癌细胞增殖。而对正常滤泡上皮细胞并没有引起明显的凋亡。即Genistein对含有BRAFV600E突变的高危甲状腺癌细胞的抑制能力明显高于不伴有BRAFV600E基因突变、而伴有RET/PTC1基因重排的PTC。第二部分Genistein在含有不同基因背景的甲状腺乳头状癌细胞的上皮间质转化中的研究方法1.选择含有不同基因背景的两种甲状腺乳头状癌细胞株,即BHP10-3 (RET/PTC1重组)和BCPAP(BRAFV600E突变),Western Blot检测细胞上皮指标E-cadherin和间叶指标vimentin的基础表达情况。2.不同浓度(0,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml)的 Genistein处理两种细胞后进行RT-qPCR和Western Blot检测EMT指标(E-cadherin, vimentin, N-cadherin, snail);同时5 μg/ml的Genistein处理细胞进行免疫荧光检测上诉指标。3.选用低浓度5 μg/ml的Genistein处理细胞进行划痕实验和transwell检测细胞的迁移和浸润能力。4.干扰掉β-catenin后transwell检测细胞迁移和浸润能力的变化,并在干扰掉β-catenin的基础上用5 μg/ml的Genistein处理细胞观察细胞迁移能力的改变。5.梯度Genistein处理后RT-qPCR和Western Blot检测β-catenin总量的变化；分别提取核浆蛋白进行Western Blot检测β-catenin核浆定位的变化,并通过细胞免疫荧光进一步验证。结果1. Western Blot结果表明：BHP10-3和BCPAP细胞发生了上皮间质转化。2. RT-qPCR和Western Blot以及细胞免疫荧光结果表明：Genistein促进上皮指标E-cadherin的表达,并抑制间叶指标vimentin, N-cadherin和snail的表达。3.划痕实验及Transwell实验结果表明：5 μ g/ml的Genistein,在未引起细胞死亡的情况下,抑制细胞的迁移和浸润能力。4. RT-qPCR和Western Blot结果表明：Genistein处理后β-catenin表达水平升高；核浆蛋白Western Blot及细胞免疫荧光证实,β-catenin在细胞浆中的表达升高,在细胞核里的表达降低。5.干扰掉β-catenin后Genistein处理,细胞的迁移能力仍被明显抑制。结论1. Genistein通过抑制wnt信号通路,减少β-catenin细胞核定位,增加其膜定位抑制甲状腺乳头状癌细胞的上皮间质转化。2.除了抑制wnt信号通路以外,Genistein尚可抑制其他信号通路,比如MAPK通路。