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研究背景及目的紫外线辐射是导致皮肤损伤、皮肤老化以及皮肤癌的主要原因。紫外线照射皮肤后,位于表皮基底层的黑素细胞通过合成黑素,传递给邻近的角质形成细胞,从而控制皮肤着色以及对皮肤起光保护作用。黑素细胞与角质形成细胞之间的这种共同完成的生理活动机制复杂,黑素细胞借其树突顶端与邻近的角质形成细胞形成接触面是黑素小体转移的先决条件。而紫外线直接刺激表皮角质形成细胞,位于表皮基底层的黑素细胞如何接收到光信号后进行黑素合成,以及如何完成黑素小体转移等一系列生理活动,是否表皮角质形成细胞先对黑素细胞发出某种信号,这些机制目前尚不清楚。我们推测表皮细胞中是否存在一种光敏感蛋白,用来启动这种快速敏捷的光敏反应。钙离子作为胞内信使,参与了多项生理活动,黑素小体通过黑素细胞树突顶端传递给角质形成细胞,需要钙通道的参与。TRPM1作为瞬时受体电位钙通道蛋白,早期研究发现其介导的钙释放可能促进黑素细胞黑素合成。而有关TRPM1在黑素小体转移中的作用机制研究目前报道较少。本课题研究内容分为三部分:1、利用钙探针动态观察紫外线刺激黑素细胞诱导的钙震荡现象,检测视蛋白OPN3、OPN5在黑素细胞中的表达变化。2、探讨不同波长紫外线(UVA/UVB)照射后黑素细胞和HaCaT细胞共培养体系中,黑素小体转移率的变化。3、检测UVA/UVB照射后TRPM1基因和蛋白在黑素细胞中的表达变化。探讨黑素细胞与HaCaT细胞共培养体系中,通过小干扰RNA转染使TRPM1低表达,甚至选取TRPM1蛋白抑制剂、G蛋白抑制剂及PLC抑制剂进行干预,探讨TRPM1通道蛋白对黑素小体转移的作用。研究方法与结果1、体外培养人原代黑素细胞,采用钙探针标记钙离子,共聚焦显微镜下动态观察UVA、UVB照射后黑素细胞内钙荧光波动变化,结果显示UVA(3J/cm~2)及UVB(20mJ/cm~2)均能诱导黑素细胞内的瞬时钙内流变化,但两者干预后出现的钙荧光波动曲线存在时程差异,UVA组的峰值时间为7.5min,UVB组的峰值时间为12.5min。Western blotting及RT-PCR、免疫荧光染色检测视蛋白OPN3、OPN5 在不同剂量 UVA(3、10、30J/cm~2)及 UVB(5、10、20mJ/cm~2)照射后的表达变化,结果显示UVA组OPN3及OPN5蛋白,UVB组OPN3蛋白在不同剂量的紫外线照射后表达量无明显变化,而UVB组OPN5蛋白的表达随剂量的增加,其表达有逐渐增高趋势。RT-PCR及免疫荧光染色结果也同样显示视蛋白OPN3及OPN5在UVA照射后变化不明显,视蛋白OPN5在UVB照射后荧光增强明显。2、建立体外人黑素细胞与角质形成细胞系HaCaT细胞共培养体系。UVA(3J/cm~2)照射后Fontana-Masson染色结果显示黑素细胞通过树突顶端接触角质形成细胞后释放黑素小体。流式细胞仪检测发现,无紫外线干预的条件下,仍有少量(19%±9)黑素小体发生转移。UVA(3J/cm~2)及UVB(20mJ/cm~2)照射后10min、30min采用流式细胞仪检测黑素小体转移情况,结果发现,UVA组在照射后10min时黑素小体转移率高于30min,而UVB组在照射后30min时转移率最高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组在加入钙螯合剂Bapta-AM及EGTA后黑素小体转移率均明显下降。3、体外培养人原代黑素细胞后,UVA(3J/cm~2)、UVB(20mJ/cm~2)照射后不同时间点(0、1Omin、30min、60min、12h、24h)RT-PCR检测发现 TRPM1 mRNA表达逐渐增高,以UVB组较显著。不同剂量UVA(3、10、30J/cm~2)及UVB(5、10、20mJ/cm~2)照射后继续避光培养24h,Western blotting检测结果显示钙通道蛋白TRPM1随着紫外线剂量的增加,其表达呈逐渐增高趋势。UVA(3J/cm~2)及UVB(20mJ/cm~2)照射黑素细胞后免疫荧光染色定位TRPM1蛋白,结果发现与未照光组及UVA组相比,UVB组TRPM1蛋白明显转移至黑素细胞树突顶端。在黑素细胞与角质形成细胞共培养体系中,加入siRNA转染使TRPM1低表达后流式细胞仪检测发现紫外线诱导的黑素小体转移率明显降低(P<0.05)。TRPM1抑制剂Voriconazole、G蛋白抑制剂Suramin、PLC抑制剂U73122均能使黑素小体转移率降低。研究结论1、UVA与UVB诱导的钙内流现象存在峰值差异,可能与UVA及UVB介导的不同晒黑反应相关。2、UVA与UVB诱导的黑素小体转移率变化趋势不同,推测可能关系到两种波长紫外线诱导黑素生成的机制不同。3、钙通道蛋白TRPM1介导的黑素细胞钙内流现象在黑素小体转移中起重要调节作用。