大足黑山羊优势卵泡和从属卵泡的转录组比较分析

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山羊优势卵泡发育是一个复杂的生理过程,受到多种调节因子的共同作用。挖掘优势卵泡发育相关转录因子和探索其分子调控机制,有助于我们更好的了解山羊繁殖生理过程,为今后高繁殖力山羊品种培育奠定基础。本研究以大足黑山羊卵泡为材料,采用RNA-seq技术对不同发育阶段山羊卵泡进行转录组测序,分析优势卵泡(GF_C:直径>4 mm)和从属卵泡(GF_T:4 mm>直径>3 mm)间多种RNA差异表达情况。并通过对差异编码基因和非编码RNA靶基因的功能注释(GO和KEGG)进一步分析它们的生物学功能,综合阐述在转录水平山羊卵泡发育可能的分子调控机制。本研究的主要内容和结果如下:(1)信使RNA(mRNA)及长链非编码RNA(lncRNA)文库测序结果显示,在两个卵泡组间共筛选到128个差异表达mRNA和4个差异表达lncRNA。差异表达的mRNA KEGG注释显示,共富集到36个信号通路中,其中包括6个与卵泡发育相关的信号通路,如Wnt信号通路、MAPK信号通路、Hippo信号通路、TGF-β信号通路和轴突导向;GO功能注释将差异mRNA富集到581个GO条目中,其中大多数GO条目与生物大分子和酶活性相关,如高分子细胞骨架纤维、超分子纤维、层粘连蛋白复合物、脱甲基酶活性、组蛋白脱甲基酶活性等。(2)MicroRNA(miRNA)文库测序共鉴定了49个组间差异miRNA(40个已知和9个新预测)。组间差异miRNA靶基因被注释到298个KEGG信号通路中,包括MAPK信号通路、Wnt信号通路、FOXO信号通路、Rap1信号通路和催产素信号通路等,其中32个信号通路与卵泡发育相关。另外,GO功能注释共发现6,225个GO条目,如细胞骨架、蛋白质结合、核酸结合转录因子活性、离子结合、激酶活性和系统发育等。(3)利用mRNA和lnRNA文库测序结果进行环状RNA(circRNA)预测,共计鉴定到13,582个circRNA,同时鉴定到290个组间差异的circRNA。对组间差异circRNA的来源基因进行KEGG信号通路注释,共富集得到192个通路,其中TGF-β信号通路,Fox O等信号通路、赖氨酸代谢、促性腺激素释放激素信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞色素P450代谢异生物等大量信号通路与卵泡发育相关。另外,GO功能注释共得到1,805个GO条目,如焦磷酸酶活性、核苷三磷酸酶活性、小分子结合和小分子分解代谢过程等。(4)通过circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA网络分析(ceRNA),共鉴定到34个节点(1个lncRNA、10个circRNA、14个miRNA和9个mRNA)和35个作用关系(17个miRNA-circRNA、2个miRNA-lncRNA和16个miRNA-mRNA)。有9个编码基因所在的ceRNA网络被鉴定出来,其中novel_circ_005369和XM_018061337.1(PITPNM2)具有最高程度的连通性。同时,通路分析结果显示,KMT2A基因仅注释在赖氨酸降解信号途径,而Pak2基因被富集到多个信号通路中(如,Erb B信号传导途径、Ras信号传导途径、MAPK信号传导途径)。(5)本研究选择了PLIN2、SPP1、miR-128-5p和miR-6412-y等共计16个不同类型RNA,通过real-time PCR(RT-PCR)验证发育不同时期卵泡的组间相对表达量,以验证转录测序和数据分析的准确性,结果显示所检测RNA的RT-PCR结果与高通量测序结果总体趋势一致。综上所述,本研究通过对大足黑山羊卵泡发育不同时期的差异表达RNA和ceRNA互作网络研究,初步筛选出了可能参与卵泡发育的候选RNA,为今后深入挖掘控制卵泡发育的关键因子及分子机制奠定基础。
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