研究背景和目的1型糖尿病（T1DM）的主要特点是胰岛素分泌减少导致的高血糖,对骨代谢的影响通常表现为患者骨量减少,骨强度下降及骨折风险增高。近年来的研究表明,骨组织中WNT/β-catenin信号通路受到抑制与上述病理过程的发生有密切关系,而此通路对于成骨细胞的增殖、分化和成熟都至关重要,并且深度参与骨骼发育和骨重塑的调控。本课题组前期研究已发现,健康小鼠的松质骨和皮质骨对WNT/β-catenin信号传导的反应不同,进而出现差异性表达。因此,本文第一部分研究系统观察了1型糖尿病小鼠松质骨和皮质骨的骨表型差异并试图找到其中的关键调控因子,然后进一步研究成骨细胞中β-catenin信号持续激活对糖尿病小鼠松质骨和皮质骨不同的调控作用及潜在机制。1型糖尿病对骨代谢的损害主要是抑制成骨细胞的功能和活性,进而导致骨量丢失。重组人甲状旁腺激素PTH（1-34）是代表性的促骨合成制剂,而其作用机制部分是通过激活WNT/β-catenin信号通路介导的。本文第二部分研究系统评估了间歇性PTH（1-34）治疗对1型糖尿病小鼠骨量丢失的改善作用,并与其对野生小鼠的作用进行比较。本文第三部分则进一步探究了适度激活成骨细胞β-catenin信号能否加强PTH（1-34）治疗对1型糖尿病小鼠的促骨生成效应并充分有效的改善骨量和骨强度。主要实验方法:第一部分:首先通过注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）建立1型糖尿病小鼠模型,然后利用可诱导Cre-LoxP系统对成功诱导糖尿病的Col1-3.2kb-Cre^ERTM;Catnblox（ex3）基因小鼠连续4天注射他莫昔芬（TM,10mg/kg）,从而持续激活成骨细胞中的β-catenin信号。据此将小鼠分为健康对照组（Control）、1型糖尿病组（T1DM）和1型糖尿病激活β-catenin组（T1-CA）。首次注射STZ后6周取材小鼠骨组织进行分析,以股骨远端、胫骨近端以及第五腰椎作为松质骨,以长骨中段作为皮质骨进行以下各项实验:1.通过X线、Micro-CT扫描、以及石蜡切片的H&E染色分析骨组织形态和骨量;2.通过压缩试验和三点应力试验分别对松质骨和皮质骨进行生物力学分析;3.通过荧光双标及硬组织切片对股骨进行骨组织形态计量分析,并检测皮质骨孔隙率;4.对胫骨石蜡切片进行TRAP染色观察并分析破骨细胞的形态和数量;5.对股骨硬组织切片进行Von Kossa染色,观察骨组织矿化情况;6.通过免疫组织化学染色观察成骨细胞和破骨细胞标志物以及信号通路的表达情况;7.通过实时定量PCR检测成骨细胞和破骨细胞标志物以及信号通路的基因表达;8.高糖环境下体外培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞,通过Western-blotting实验检测信号通路相关因子的蛋白表达;9.提取基因型为Catnblox（ex3）小鼠的原代成骨细胞在高糖环境下培养,并利用Cre腺病毒感染激活β-catenin,检测细胞培养液中相关因子蛋白水平,并通过定量PCR检测相关因子基因表达。第二部分:首先建立1型糖尿病小鼠模型,成功后继续喂养3周达到骨质流失,然后给小鼠注射PTH（1-34）或生理盐水（75μg/kg/天）共3周。据此将小鼠分为野生对照组（WT）、野生PTH治疗组（WT+PTH）、1型糖尿病组（T1D）以及糖尿病PTH治疗组（T1D+PTH）。治疗结束后1周取材骨组织并进行以下实验:1.通过Micro-CT扫描分析股骨和第五腰椎的骨组织形态和骨量;2.通过荧光双标及硬组织切片后进行骨组织形态计量分析;3.通过TRAP染色观察并分析破骨细胞的形态和数量;4.通过BrdU免疫组织化学染色检测细胞增殖;5.通过TUNEL法检测骨组织细胞凋亡;6.通过免疫组织化学染色观察成骨细胞标志物及β-catenin的蛋白表达情况;7.通过定量PCR检测凋亡相关因子及PTH/β-catenin通路的基因表达。第三部分:适度激活成骨细胞β-catenin信号是利用Col1-3.2kb-Cre^ERTM;Catnblox（ex3）基因小鼠通过单剂量注射他莫昔芬（TM,15mg/kg）实现的。选取上述基因小鼠及同窝非基因小鼠成功建立1型糖尿病模型后,继续喂养3周,然后单剂量注射1次TM,3天后对基因鼠或非基因小鼠注射PTH（1-34）或生理盐水（75μg/kg/天）共3周。据此将小鼠分为1型糖尿病对照组（T1D*）、糖尿病PTH治疗组（T1D*+PTH）、糖尿病适度激活β-catenin组（T1D*+TA）以及糖尿病联合治疗组（T1D*+TA+PTH）。治疗结束1周后取材并进行以下实验:1.Micro-CT扫描及石蜡切片H&E染色分析长骨和椎体的骨组织形态和骨量;2.三点应力试验对股骨进行生物力学分析;3.荧光双标及硬组织切片后进行骨组织形态计量分析;4.硬组织切片行Von Kossa染色,观察骨组织矿化情况;5.TRAP染色观察并分析破骨细胞的形态和数量;6.免疫组织化学染色检测BrdU细胞增殖,并观察成骨细胞标志物的蛋白表达;7.提取骨髓脂肪组织RNA后定量PCR检测成脂相关因子的基因表达;8.通过Western Blotting实验检测PTH和WNT/β-catenin信号通路的蛋白表达;9.分离小鼠原代骨髓基质细胞并进行成骨诱导培养,通过定量PCR检测成骨分化因子的基因表达,通过茜素红矿化结节染色检测成骨分化水平;10.分离小鼠原代成骨细胞培养后,通过定量PCR检测PTH和WNT/β-catenin信号通路的基因表达。主要实验结果:第一部分:1型糖尿病小鼠松质骨和皮质骨的骨表型差异及WNT/β-catenin信号通路对其不同的调控作用1.成功建立1型糖尿病小鼠模型表现为空腹血糖高于16.7mmol/L,并出现多尿、多饮、多食的典型症状,体重明显下降。2.与Control小鼠相比,T1DM小鼠在长骨和椎体骨都表现出明显的骨量降低,而且松质骨骨量下降的程度要明显大于皮质骨。3.在T1DM小鼠骨组织中,反映骨形成的形态计量学指标N.Ob/T.Ar、Ob.S/BS、BFR以及成骨细胞分化标志物OSX和ALP的基因表达与Control小鼠相比都有明显下降,且松质骨降幅更大,与骨量下降的差异化趋势一致。而反映骨吸收的形态计量学指标N.Oc/T.Ar和Oc.S/BS在T1DM小鼠的骨组织中与Control小鼠相比无明显变化,松质骨和皮质骨之间也没有明显差异。4.β-catenin信号及其下游因子LEF-1、TCF和Axin2的表达水平在T1DM小鼠骨组织中显著下降,而且松质骨中下降幅度比皮质骨更大,这与上述骨量和骨形成下降的差异化趋势一致。5.T1DM小鼠骨组织中IGF-1R的表达较Control小鼠降低,而且在松质骨中的降幅明显大于皮质骨。进一步离体细胞实验表明,在高糖环境下培养的MC3T3-E1细胞中,IGF1R、pAKT、GSK3β以及β-catenin的蛋白表达均受到明显抑制。6.T1-CA小鼠与T1DM小鼠的松质骨对比,骨量大幅增加,同时骨形成的形态计量学指标,以及成骨细胞早期标志物RUNX2和OSX的表达水平也都大幅上升,但晚期标志物OCN的水平无明显变化。而骨吸收的形态计量学指标出现下降,与之相伴的是T1-CA小鼠OPG的高表达和RANKL/OPG表达比率的下降。此外,T1-CA小鼠松质骨的矿化水平和生物力学指标也有明显提高。7.T1-CA小鼠与T1DM小鼠的皮质骨对比,骨量仍有增加,但增幅与松质骨相比减少很多,骨形成指标以及成骨细胞标志物的变化趋势也与骨量一致。8.T1-CA小鼠皮质骨内缘破骨细胞活动明显增强,形态计量学显示T1-CA小鼠N.Oc/T.Ar和Oc.S/BS与T1DM小鼠相比增幅分别达125.6%和86.9%,与之相伴的是皮质骨孔隙率的增加。同时,T1-CA小鼠的皮质骨矿化水平和生物力学指标与T1D小鼠相比无明显改善。9.与T1DM小鼠相比,T1-CA小鼠皮质骨中OPG的表达升高而RANKL/OPG表达比率下降,这与松质骨中的趋势类似。10.T1-CA小鼠皮质骨中WNT16的表达水平与T1D小鼠相比大幅下降,WNT5a的表达没有发生明显变化。同时,各组小鼠中均观察到皮质骨的WNT16的蛋白表达水平显著高于松质骨。体外细胞实验证实,高糖环境下激活β-catenin信号可抑制WNT16的表达,但对WNT5a没有明显作用。第二部分:间歇性PTH（1-34）治疗对1型糖尿病小鼠的促骨合成效应出现明显的钝化作用,可能机制是β-catenin信号无法被PTH有效激活1.间歇性PTH（1-34）治疗3周能够增加T1D小鼠的骨量,TID+PTH小鼠与之相比,在股骨远端、中段以及第五椎体的Micro-CT扫描骨量指标BV/TV、BA/TA和L5.BV/TV的增幅分别为+16%、+8%和+21%。但WT+PTH小鼠与WT小鼠相比上述三个指标的增幅分别达到+67%、+31%和+75%。2.骨组织形态计量结果显示,PTH（1-34）治疗后TID+PTH小鼠与T1D小鼠相比松质骨和皮质骨的骨形成率增加幅度均明显小于WT+PTH小鼠对应的增幅。而骨吸收相关指标N.Oc/T.Ar和Oc.S/BS在TID+PTH小鼠和WT+PTH小鼠都有增加,且增幅没有显著差异。3.BrdU免疫组化检测细胞增殖结果显示,TID+PTH小鼠与T1D小鼠相比阳性细胞数量没有明显增加,而WT+PTH小鼠对应WT小鼠阳性细胞增加非常明显。Runx2和骨钙素（OCN）的免疫组化结果与BrdU的趋势一致。而TUNEL法检测细胞凋亡显示,TID+PTH小鼠和WT+PTH小鼠与各自对照组相比凋亡细胞数量均明显减少。同时实时定量PCR检测发现,促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2的表达在TID+PTH小鼠和WT+PTH小鼠的变化趋势和幅度也基本相同。4.TID+PTH小鼠与T1D小鼠相比,骨组织中PTH1R和LRP6两种受体的基因表达都显著升高,但β-catenin蛋白及下游目的基因TCF、LEF-1和CyclingD1的表达都没有明显变化。而WT+PTH小鼠对应WT小鼠上述各个因子的表达均有大幅升高。第三部分:适度激活成骨细胞β-catenin信号能够显著加强PTH（1-34）对1型糖尿病小鼠的促骨生成效应,并充分改善骨量丢失和骨强度损伤1.在糖尿病小鼠中适度激活成骨细胞β-catenin信号再联合PTH（1-34）治疗3周,促骨合成效应增强非常显著,T1D*+TA+PTH小鼠椎体骨和股骨的Micro-CT扫描骨量指标都明显高于T1D*+PTH小鼠和T1D*+TA小鼠。2.三点应力试验和Von Kossa染色结果显示T1D*+TA+PTH小鼠的生物力学指标以及骨矿化水平分别与T1D*+PTH小鼠和T1D*+TA小鼠相比均有明显提高。3.骨代谢的相关指标分析结果显示,T1D*+TA+PTH小鼠的成骨细胞增殖、骨髓前成骨细胞早期分化的促进作用非常显著,同时骨髓脂肪组织水平得到明显改善,效果与T1D*+PTH小鼠和T1D*+TA小鼠相比均有明显提高;4.Western-blotting实验结果显示,联合治疗组小鼠骨组织中PTH1R/LRP6/β-catenin通路及下游目的因子的蛋白表达水平均有明显升高,而WNT/β-catenin通路抑制因子SOST的表达则明显降低。5.提取原代成骨细胞和骨髓基质细胞进行体外实验也证实,T1D*+TA+PTH小鼠间充质细胞的成骨分化能力及成骨细胞中上述信号通路的基因表达水平均高于其余各组。主要结论:1.1型糖尿病小鼠中松质骨的骨量丢失以及骨形成受到抑制的程度均大于皮质骨,这种差异可能与骨组织中β-catenin信号水平在松质骨受到的抑制程度比皮质骨更强有关。2.持续激活成骨细胞中WNT/β-catenin信号通路可以明显改善1型糖尿病小鼠松质骨骨量丢失并增强松质骨矿化水平和生物力学强度,但同时也可能通过抑制皮质骨中WNT16表达增强皮质骨内缘破骨细胞活动,进而增加皮质骨孔隙率,这对皮质骨的骨强度有潜在危险。3.间歇性PTH（1-34）治疗能够部分改善1型糖尿病小鼠的骨量丢失,但其促骨合成效应与野生小鼠相比出现明显的钝化作用。1型糖尿病高糖状态对成骨细胞WNT/β-catenin信号通路的直接抑制,导致PTH（1-34）治疗无法有效激活β-catenin信号,这可能是出现钝化作用的原因。4.适度激活成骨细胞β-catenin信号能够显著加强PTH（1-34）治疗对1型糖尿病小鼠的促骨生成效应,二者联合治疗能充分有效的改善糖尿病小鼠的骨量丢失和骨强度损伤。因此,未来将β-catenin作为潜在的治疗靶点,可以有效提高PTH（1-34）对1型糖尿病性骨质疏松的治疗效果。