化学生物学作为一门交叉学科,是利用化学知识和技术解决生命活动中的问题的学科,也是近些年来逐渐兴起的领域。越来越多的研究者尝试把化学和分子生物学尽可能完美的结合在一起,而遗传编码非天然氨基酸作为化学生物学这一领域的杰出代表,被广泛应用于蛋白质翻译后修饰、蛋白荧光标记、蛋白质结构分析、基于荧光蛋白的各种探针等领域。这种新颖而实用的方法可以广泛应用到大肠杆菌、酵母、和动植物中。目前,通过在细胞中引入外源的特殊密码子和相应的tRNA/氨酰tRNA合成酶正交对,已有超过80种具有各种各样的物理、化学、生物学性质的非天然氨基酸被高效的编码到目标蛋白的特定位点。这些非天然氨基酸包括:具有敏感核磁核磁信号的氨基酸、具有反常散射的氨基酸、能螯合金属离子的氨基酸、有荧光特性的氨基酸、具有表观遗传学中各类修饰的氨基酸、具有特殊光化学性质的氨基酸,以及具有氧化还原活性的氨基酸。如果把化学生物学比作一个直角坐标系,横轴是化学学科,纵轴是生命科学学科,那么他们的交叉点应该是结构生物学,结构生物学无疑是直接从原子、分子、化学键的角度来解释、分析生命体系中机制的最有力武器。在遗传编码非天然氨基酸领域更是如此,无论是翻译正交系统的建立,非天然氨基酸的筛选,还是编码非天然氨基酸的特定蛋白质执行功能的结构机理,都离不开结构生物学强有力的支持。第一个成功利用tRNA/合成酶正交对来编码非天然氨基酸的是酪氨酸合成酶及改造后的Mj tRNATyr,来自古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii,简称Mj),正是基于这个合成酶和对应的tRNA、底物酪氨酸、ATP类似物的复合物结构。2002年发现在古细菌甲烷八叠球菌甲胺甲基转移酶含有TAG stop codon编码的吡咯赖氨酸,之后解析的吡咯赖氨酸合成酶及其底物的复合物结构也为基因密码子扩展的重要基础。在用于筛选各种非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶的突变文库构建以及催化特定非天然氨基酸合成酶的效率改善过程中,氨酰tRNA合成酶与其底物氨基酸或非天然氨基酸的相互作用机制为其提供了可靠而且有指向性的依据。同样,如果编码非天然氨基酸的蛋白与之前的野生型蛋白在性质和功能上有明显的差异,就可以从结构生物学角度阐述加入非天然氨基酸后对蛋白构象的影响,进而解释其性质和功能的变化。生物大分子X射线衍射技术,凭借其独特的优势,已经成为结构生物学的主流研究手段,已经广泛应用于生命科学、化学、医学、药学等诸多领域。作为非专业从事结构生物学的研究者,如何快速、准确的利用好这个有力的技术也成为越来越多科研人员的迫切要求。本文的第一部分从一个非专业者的角度描述了如何学习、掌握结构生物学知识和实验技术的过程。本研究采用遗传编码非天然氨基酸方法,从以下两个方面进行了相关实验:1.酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究酪氨酸磷酸化是在蛋白质中特定位点的酪氨酸的酚羟基上共价连接一个磷酸根基团,是最重要的蛋白质翻译后修饰的方式之一,其蛋白质构象变化、蛋白-蛋白相互作用的调节在以及酶的活性调节过程中,扮演着举足轻重的角色。磷酸酪氨酸激酶活性中心的酪氨酸非正常磷酸化会导致许多疾病滋生,尤其与癌症的发生密切相关。细菌中的毒性激活机制也和酪氨酸磷酸化有关系。目前,各种针对酪氨酸激酶活性中心设计的小分子抑制剂是治疗肿瘤的主要方法。但是随着患者的病情发展,酪氨酸激酶中的药物靶点的氨基酸会不断突变,愈来愈多的患者对以前使用的抗肿瘤药物逐渐产生了耐药性,治疗效果也大大削弱。因此,有必要发展更高效灵敏的方法来检测酪氨酸激酶活性中心尤其是药物靶点的构象的变化。19F核磁共振是近几年兴起的一种探究酶的催化作用机制和蛋白构象如何变化的一种有利工具。因为氟在蛋白中的丰度为零,而且在NMR中有着十分敏感的化学信号,并且其对周围的化学环境十分敏感。所以,人们发展了许多化学合成与生物转化的方法来编码含氟的非天然氨基酸。在这些方法中,基因编码非天然氨基酸具有独特的优势,因为其可以在蛋白质的特定位点插入含氟的非天然氨基酸,并且其产量相对来说很高,可以达到每升菌毫克级别。遗憾的是,目前还没有利用19F NMR研究酪氨酸磷酸化的相关报道。在利用大肠杆菌作为宿主表达目的重组蛋白的过程中,我们在加入含有19F的酪氨酸类似物3,5-二氟-L-酪氨酸(F2Y),并应用基因编码非天然氨基酸的方法实现了原核酪氨酸激酶Etk活性中心Tyr574位点的定点19F标记。这些定点标记的3,5-二氟-L-酪氨酸位点在磷酸化和去磷酸化的不同状态下,其核磁共振的化学位移会表现出差别,而且信号的强度变化可以直接反应相应的磷酸化酪氨酸所占比例的变化。此外,我们应用19F固体核磁共振方法,对一种肿瘤形成中关键的非受体酪氨酸激酶Src进行了磷酸化水平的分析。通过19F NMR的检测,我们发现dasatinib(一种针对c-Src的抗肿瘤药物)与激活状态的c-Src结合后会引起c-Src活性中心的a-loop构象变化。这些研究不仅为研究酪氨酸激酶的激活机制提供了重要的研究手段,也可以基于酪氨酸激酶与底物相互作用关系筛选新的抗肿瘤药物。2.基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白电子传递(ET)涉及生物体内许多重要的生化过程,包括光合作用和细胞色素P450介导的氧化反应等。目前,研究与生命活动相关的蛋白质中的电子转移已经取得了长足的发展。在合成生物学领域,通过改造生物体内的各个元件来实现人为可以控制的高效率的光致电荷分离,是现阶段生产可再生能源的最紧要瓶颈。目前,还只能依靠把探针连接到蛋白质本身的组氨酸或半胱氨酸残基上来测量蛋白质中的电子传递。通常,这也决定了这种方法只能限制在比较小的可溶性蛋白的研究方面,这大大限制了其应用。光致电子传递(PET)产生的荧光淬灭现象是用来探究生物大分子中构象变化的一种可靠方法。高效的光致电子转移需要电子供体和受体之间的距离足够近(小于14埃),在对生物大分子中构象的微小变化进行研究时,利用光致电子传递引起的荧光淬灭可以弥补荧光共振能量转移(FRET)方法的诸多不足,但由于技术所限,前者只可以用酪氨酸或色氨酸当电子供体。我们把一种结合金属离子的非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)在大肠杆菌中编码到荧光蛋白中,第一次实现了在荧光蛋白发色团至二价铜离子之间的快速光致电子转移过程,并测定电子转移在1纳秒的时间以内(此速度接近光系统中心的速度)发生。我们获得了 3-吡唑基酪氨酸高效结合二价铜离子的结构生物学基础。这些新方法为金属蛋白设计提供了新的研究手段,为了解析蛋白质动态构象变化研究提供了新的科学视角,为改造生物体内的各个元件来实现人为可以控制的高效率的光致电荷分离提供了新的研究思路。我们还合成了新一代的8-羟基喳啉丙氨酸(HqAla),其螯合金属离子能力更强。通过基因编码非天然氨基酸的方法,我们在大肠杆菌中实现了将HqAla编码到重组蛋白中。其中,在一些荧光蛋白如sfYFP、sfGFP、PsmOrange和eqFP650的发色团编码8-羟基喹啉丙氨酸,我们发现这些荧光蛋白的最大发射波长均红移大约30nm。其中,eqFP650-67-HQAla的发色团的最大吸收峰红移至680 nm,这是目前为止有文献报导的发射波长最大的荧光蛋白。这些突变体可以作为一种标签,在体内成像研究中,提高检测的灵敏度,可以用于深层组织成像以及作为荧光共振能量转移传感器的能量受体(acceptor)。深入地研究锌离子对生命活动的调控机理需要特异且敏感的锌离子感应器,由于该非天然氨基酸可以在活细胞中编码,所以其可作为选择性检测锌离子的生物传感器。8-羟基喹啉丙氨酸和铜离子结合能力是我们之前报道的3-吡唑酪氨酸的九百万倍,所以这个氨基酸是比3-吡唑酪氨酸更加优良的光致电子转移探针,无疑为探究蛋白质中光致电子转移现象提供了更加有力的技术支持。综上所述,我们的研究成果为利用顺磁共振研究蛋白质动态构象变化提供了有力的技术支持,为蛋白传感器的设计提供了新的工具,也为金属蛋白的理性设计方面提供了更独特的视角。