背景与目的：肿瘤发生是一个很漫长的过程,其发生的基础是在内外环境各种致癌因素的作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。其中,恶性肿瘤最重要的特点是能够局部浸润和远处转移,这个特点是恶性肿瘤导致人类死亡的主要原因。临床上经常对恶性肿瘤进行分期与分级。分期是指,根据原发肿瘤的大小、浸润深度、累及范围以及是否侵袭邻近器官、有无淋巴结转移、有无血行或其他方式的远处转移,来确定肿瘤发展的程期或早晚。国际上广泛采用TNM分期系统。T是指肿瘤的原发灶,随着肿瘤的增大依次用T1—T4来表示；N指局部淋巴结受累及,淋巴结未累及是用N0表示,随着淋巴结受累及的程度和范围的扩大,依次用N1—N3表示；M指远处转移,无远处转移者用M0表示,有远处转移用M1表示。关于肿瘤的分级,Ⅰ级为分化良好,属低度恶性；Ⅱ级为分化中等,属中度恶性；Ⅲ级为分化很差,属高度恶性。不同的肿瘤,临床表现也各有差异。如肝癌,早期表现就不典型,容易被忽视,常常表现为：(1)食欲明显减退,腹部闷胀,消化不良伴恶心呕吐；(2)右上腹隐痛,肝区持续或间歇性疼痛,可因体位变动而加重；(3)全身乏力、消瘦、不明原因的发热及水肿；(4)黄疸、腹水、皮肤瘙痒；(5)常常表现为鼻出血、皮下出血等。不同的患者临床表现也不尽相同,以上肝癌的五种临床表现也并非同时出现。又如宫颈癌,早期也无明显的症状与体征,随着疾病的发展可表现为：(1)阴道流血；(2)阴道排液,白色或血性液体；(3)晚期根据癌灶累积范围出现不同症状,如尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等。目前研究的结果已表明肿瘤是多种基因突变累积的结果。其中包括癌基因、抑癌基因和DNA修复基因等。在人类肿瘤中,常见的癌基因有H-ras、K-ras和N-ras,还有sis家族的sis基因,另外还有src家族,myc家族,myb家族；常见的抑癌基因有Rb基因、p53基因和p16基因等。绝大多数肿瘤基因的变异包括点突变、扩增、重排、缺失或甲基化状态的改变,都是体细胞变异。基因的点突变是导致这一类基因功能改变的主要方式之一[1],上个世纪80年代有学者发现H-Ras基因第12位密码子GGC突变为GTC,从而使编码的甘氨酸变为缬氨酸,使其产物P21蛋白的结构发生改变导致Ras基因的活化。N-Ras是后来在人类神经母细胞瘤中鉴定出的另一个转化基因,与Ras高度同源。通过几十年的研究,目前对Ras信号通路也基本上有较为全面的认识。癌基因活化的另一种主要方式是基因扩增,但在某些情况下,由于基因调控区的变异,在基因没有扩增的情况下也会发生过量表达。因此认为,基因扩增和过量表达其结果均可影响细胞的正常生理功能[4]。在细胞癌变过程中,DNA甲基化状态的改变是很重要的一步,它可以导致基因异常表达和功能异常。另外,抑癌基因在肿瘤的发生过程中也起到了很重要的作用,抑癌基因的生物学功能与癌基因相反,它在细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用,若其功能缺失则可导致细胞发生恶性转化而发生肿瘤。Bcl-2也是一种癌基因,最初是从B细胞淋巴瘤中鉴定出来的。已有研究表明,Bcl-2基因编码的蛋白产物是抗凋亡因子。因此,肿瘤的发生也是一种与细胞凋亡、细胞周期密切相关的疾病。但近期最新研究发现,Bcl-2蛋白家族不仅仅是起抗凋亡作用,它可被分为两大类,一类是抗凋亡蛋白,另一类是促凋亡蛋白。促凋亡的Bcl-2蛋白又可分为多样BH域和唯BH3域蛋白。因此,一种新兴的肿瘤治疗方法是,通过降低抗凋亡Bcl-2蛋白的活性或者提高促凋亡Bcl-2蛋白的功能来直接激活凋亡途径,来达到治疗肿瘤的目的,但此方法尚不成熟还有待进一步研究。有学者提出可以通过明确一些能够激活促凋亡Bcl-2蛋白的小分子来实现这样的目的。另外,多数肿瘤细胞缺少抑癌基因p16,导致肿瘤细胞细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle2, CDC2)过度表达,从而引起细胞过度增殖发生癌变。在细胞周期G2/M点起关键调控作用的是Cdc2-cyclin B复合物,这包括了Cdc2第14位苏氨酸、第15位酪氨酸的磷酸化(失活状态),以及第161位苏氨酸的磷酸化(活化状态)。另外,有研究表明,Cdc2的活化能够引起caspase-3的激活,而caspase-3在细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。基于上述研究成果,我们将从肿瘤细胞的细胞周期以及细胞凋亡机制方面出发,选用缺乏p16基因的人宫颈癌HeLa细胞株进行研究,探索Cdc2在LPS诱导的细胞凋亡中与肿瘤发生可能存在的关系。本实验中我们主要借助Gateway载体构建技术,通过反转录克隆Cdc2mRNA,我们构建了Cdc2真核表达载体,通过测序验证获得的是正确的Cdc2真核表达载体。然后我们用这个真核表达载体来转染HeLa细胞,通过Western blot等实验技术来观察其在细胞中的表达情况,再借助于流式细胞仪检测它的细胞周期以及细胞凋亡情况,从而探讨其在细胞凋亡和周期与肿瘤发生可能存在的关系。研究方法：1.引物设计与合成,根据NCBI上公布的Cdc2的CDS序列(NM001786.4),用Primer5.0软件设计上下游引物,并由上海英骏生物技术有限公司完成。2.培养人骨肉瘤U20S细胞,消化收集细胞之后加入裂解液裂解细胞,根据invitrogen的RNA提取试剂盒提供的吸附柱,过柱子提取总RNA。3.Cdc2片段的PCR扩增,通过逆转录总RNA得到cDNA,再根据所设计好的Cdc2引物进行PCR反应,94℃预变性2min,98℃变性10s,62℃退火30s,68℃延伸50s,共进行30个循环。4.DH5α感受态的制作,将E. coli DH5a菌用CaC12处理之后,使之细胞通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。5. Cdc2TA亚克隆,把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来,因为PCR反应中所用的聚合酶具有末端转移的活性,会在3’加上A。6.构建真核表达载体pDEST-Cdc2,通过LR连接反应将Cdc2TA亚克隆与目的载体pDEST连接起来,再转化感受态细胞,涂布平板；挑单克隆于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养,测序正确后进行大量扩增目的质粒。7.用Lipofectimaine2000将pDEST-Cdc2质粒转入人宫颈癌HeLa细胞,并用蛋白质印迹法western blot检测转染效果。8. HeLa细胞凋亡率检测,根据Annexin V能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合,PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞,两者匹配使用能将凋亡早期细胞和晚期细胞以及死细胞区别开来。9. HeLa细胞周期检测,用碘化丙啶(propidium iodide, PI)孵育细胞之后,上流式细胞仪检测细胞周期。10.统计分析：所有数据均以均数±标准差(±)表示,采用SPSS13.0软件进行单向方差分析(One-Way ANOVA),两两比较方差齐性时采用LSD方法,方差不齐时采用Dunnett3法,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.用Primer5.0软件设计上下游引物结果如下：Cdc2上游引物5’-GAAGATTATACCAAAATAGAGAAAA-3’下游引物5’-CTACATCTTCTTAATCTGATTGTCC-3’; PCR结果验证改引物是正确引物。2.人骨肉瘤U20S来源的Cdc2片段的PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果显示已经成功扩增Cdc2片段。3.把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来来进行Cdc2TA亚克隆,经琼脂糖凝胶电泳鉴定与预想大小一致。并用Xbal限制性内切酶酶切之后经凝胶鉴定插入正确。4.通过LR连接反应将Cdc2TA亚克隆与目的载体pDEST连接起来,转化DH5α感受态细胞,涂布平含100μg/ml氨苄青霉素的平板；挑单克隆于LB培养基培养,提取质粒之后经测序鉴定构建成功。5.用蛋白质印迹法western blot检测质粒pDEST Cdc2转染人宫颈癌HeLa细胞效果,结果证实pDEST Cdc2成功转进了人宫颈癌HeLa细胞。6.采用Annexin-V/PI双染流式细胞计数检测细胞凋亡,结果显示,在含10%FCS的DMEM中培养时,HeLa细胞自然凋亡率(7.16±2.19)%；在LPS刺激24h之后,HeLa细胞凋亡率增高至(20.65±1.66)%(P<0.05)；而经过转染pDEST27-Cdc2质粒的HeLa细胞仅为(10.80±0.38)%(P<0.05)。为了研究Cdc2与LPS刺激引起的细胞凋亡的关系,采用Western blot检测LPS刺激以后Cdc2的变化,发现经LPS刺激以后HeLa细胞中Cdc2蛋白表达明显下降。7.流式细胞仪检测细胞周期显示Cdc2可明显减轻LPS刺激后的G2期阻滞,转染组与未经转染但经LPS刺激的HeLa细胞相比,pDEST27-Cdc2转染组明显减轻LPS刺激后的G2期阻滞,G2/M期细胞比例明显减低(P<0.01)。结论：1.脂多糖LPS诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡与细胞分裂周期蛋白2Cdc2密切相关,凋亡检测结果显示Cdc2能够帮助肿瘤细胞逃过凋亡信号的诱导并继续维持细胞分裂状态,说明Cdc2在肿瘤的发生发展中起了很重要的作用。2.LPS诱导HeLa细胞凋亡是由于其导致Cdc2表达下降,细胞分裂停止在G2/M期,过表达Cdc2可以阻止死亡信号诱导的细胞凋亡。这些表明,Cdc2可能是潜在的新的肿瘤治疗靶点。