阿尔茨海默病是老年人中最常见的神经退行性病。该病的主要病理学特征为脑内神经元斑块沉积和神经原纤维缠结,并引发神经突触和脑内神经元缺失。随着世界人口的老龄化加剧,阿尔茨海默病的发病率日趋上升,已成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一,然而,目前尚不清楚神经元退变损伤的分子机制,临床上对阿尔茨海默病亦缺乏有效地治疗手段。研究表明,p-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Ap)的沉积是阿尔茨海默病的始发因素和关键环节,是脑内神经元纤维缠结、神经元丢失的直接因素。Aβ可导致神经元损伤,诱导细胞凋亡。因此,降低Ap细胞毒性、抑制Ap异常沉积已成为研究阿尔茨海默病发病机制,寻找治疗方法的关键点。近年来有关中药治疗阿尔茨海默病的研究越来越多。白藜芦醇是一类广泛存在于葡萄、虎杖等植物中的多酚类化合物。具有抗氧化、抗炎症、抗癌及抗衰老等作用。最近的研究发现,白藜芦醇对H2O2、MPP、Aβ及6-羟多巴胺诱导的神经元损伤中都有一定的保护作用,并能够有效延缓阿尔茨海默病和亨汀顿舞蹈症的认知、学习、记忆与行为功能障碍。白藜芦醇对神经元的保护作用已经引起神经科学家的广泛关注。白藜芦醇可以通过调控多个基因和信号通路而发挥神经保护的作用。研究发现,白藜芦醇能诱导沉默信号调控因子(Silence signal regulating fator1, SIRT1)的高表达,从而引起一系列信号通路的改变。SIRT1是沉默信号调控因子sir-2的同源物,它参与基因转录、延长复制周期、能量代谢及延缓细胞衰老等生物过程。在阿尔茨海默病模型大鼠研究中发现,大鼠脑内SIRT1高表达能增强淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的非淀粉样蛋白分解途径,减少Aβ的沉积。在SIRT1对阿尔茨海默病的保护机制研究中发现,SIRT1转基因小鼠来源的原代神经元中,β-淀粉样蛋白含量减少,同时ROCK1的表达降低。以往的研究也发现,ROCK1能够调节α-蛋白激酶活性,与淀粉样前体蛋白的代谢有关。这说明SIRT1增强α-分泌酶介导的APP非淀粉样蛋白途径可能部分通过ROCKl通路,然而,SIRT1与ROCK1之间的调控关系以及二者在白藜芦醇对抗Aβ诱导神经元损伤中的作用并不清楚。基于以上的研究,为探讨白藜芦醇对Aβ25-35毁损神经元的保护作用,并探讨SIRT1和ROCKl在该过程中的作用机制,我们设计了本项实验：(1)选用PC12细胞作为神经元培养模型,加入不同浓度的Aβ25-35,观察Aβ25-35对PC12细胞的损伤情况;(2)在Aβ25-35毁损PC12细胞的培养基内加入不同浓度的白藜芦醇,通过MTT和LDH检测,观察白藜芦醇对Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用,并分析筛选出其最佳保护浓度；(3)通过Hoechst33342/PI双染、流式细胞术及细胞内钙离子浓度检测分析白藜芦醇对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡情况的影响；(4)为进一步探讨探讨白藜芦醇发挥神经保护作用的分子机制,我们应用RT-PCR和Western blot技术检测了SIRT和ROCK1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化；(5)应用尼克酰胺(SIRT1的抑制剂)和Y-27632(ROCK1的抑制剂)处理PC12细胞,进一步明确SIRT1及ROCK1在白藜芦醇对抗Aβ25-35毁损PC12细胞中的作用及二者之间的调控关系。本实验的研究结果显示,(1)给予10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的Aβ25.35毁损PC12细胞,可见细胞的突起从远端开始崩解、碎裂。随着Aβ25-35浓度的升高,PC12细胞毁损逐渐加重。MTT结果显示细胞活性与Aβ25-35浓度呈负相关。在Aβ25-35的三个浓度组中,20μmol/L浓度伤易于观察与检测,作为后续实验中细胞损伤的选用浓度。在A825-35毁损前2h,给予12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L四个浓度的白藜芦醇预孵育PC12细胞,经细胞生长观察及MTT. LDH细胞活性分析,各浓度组均呈现明显的保护作用(P<0.01),其中50μmol/L白藜芦醇保护组的保护作用强于其他浓度组(P<0.01),选为研究白藜芦醇保护作用的使用浓度。(2) Hoechst33342/PI双染结果显示,白藜芦醇保护组的细胞凋亡率明显低于Aβ25-35损伤组(P<0.01)；流式细胞术检测结果显示,白藜芦醇能够有效地同时抑制Aβ25-35诱导的早期凋亡和晚期凋亡(P<0.01)；细胞内钙离子浓度检测结果显示,Aβ25-35损伤组细胞钙离子荧光强度较空白对照组明显增强,钙离子浓度显著升高,给予白藜芦醇保护以后,钙离子荧光强度较Aβ25-35损伤组明显减弱(P<0.01)。(3) RT-PCR和Western blot的结果均显示,AP25-35抑制SIRT1的表达,同时增强ROCK1的表达(P<0.01),给予白藜芦醇后,可明显增加PC12细胞SIRT1表达,降低ROCK1表达(P<0.01)。为进一步明确SIRT1及ROCK1的作用及调控关系,本实验应用了SIRT1的抑制剂尼克酰胺和ROCK1的抑制剂Y-27632,结果显示,尼克酰胺显著地抑制SIRT1的表达并激活ROCK1的表达(P<0.01)；Y-27632明显抑制ROCK1的表达(P<0.01),而对SIRT1的表达几乎没有影响。以上数据说明,ROCK1是SIRT1下游的一个信号分子,并且受SIRT1的负调控。本项研究表明,白藜芦醇通过激活SIRT1进而抑制其下游信号分子ROCK1,对抗β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡,发挥神经保护作用。SIRT1-ROCK1信号通路在阿尔茨海默病的病理机制中起着重要的作用。