乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,全世界每年有超过一百万的新发病例。该疾病在肺癌,肝癌,胃癌和结肠直肠癌之后排在第五位,且发病率随着年龄的增长而增加。根据肿瘤大小,肿瘤类型,肿瘤等级,淋巴结状态或激素受体状态,进行相应的治疗策略,如手术、靶向治疗、激素治疗、化学疗法、放射疗法或两者结合。实际上,这些治疗方法都会对健康组织造成不良损害。此外,许多因素也可能导致治疗失败,例如手术后残留的癌细胞,对化学疗法的抵抗力,针对治疗的生理障碍,如血脑屏障和阻碍获得治疗的细胞屏障。因此,需要副作用小且有效低毒的天然化学治疗剂。β-榄香烯是从莪术中提取的一种倍半萜类活性化合物,它已被国家食品药品监督管理局批准用于抗癌治疗,包括脑癌,前列腺癌,卵巢癌和肺癌。β-榄香烯具有广泛的抗肿瘤活性,它可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制新生血管形成,抑制肿瘤侵袭和转移。β-榄香烯是一种天然植物来源的成分,因其安全性和较少的不良反应,使其成为癌症治疗的有效药物。尽管β-榄香烯可以诱导各种肿瘤细胞凋亡,但关于β-榄香烯抑制乳腺癌细胞MCF-7生长的体内外研究很少,其机制尚不明确。本课题探究β-榄香烯对乳腺癌的治疗效果,并进一步探索其涉及的分子机制。目的:探究β-榄香烯在体内外抑制乳腺癌细胞MCF-7生长及相关分子机制。方法:1体内实验:雌性SPF级BALB/c裸鼠(35-42天),体重16-18g,构建人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤模型后,随机分为模型组、50mg/kgβ-榄香烯组(低剂量组)、100mg/kgβ-榄香烯组(高剂量组)和25mg/kg5-FU组(阳性对照组),每组六只。β-榄香烯给药组和阳性对照5-FU组隔天每只腹腔注射给药一次,模型组给予相同体积的0.9%Na Cl溶液。每2天称量各组裸鼠重量,并在实验过程中每3天使用游标卡尺测量各组裸鼠的肿瘤大小,21天后麻醉处死裸鼠,分离瘤体并称重,于4%多聚甲醛溶液中固定。计算各组瘤块体积和移植性肿瘤抑制率,HE染色用于观察各组肿瘤细胞的形态差异。TUNEL染色用于评估β-榄香烯对肿瘤细胞凋亡的影响,细胞增殖相关的核抗原(Ki-67)染色用于评估人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的增殖,免疫组化法检测LOX和Cyclin D1蛋白表达水平,免疫荧光法检测p-mTOR蛋白表达水平。2体外实验:选取人乳腺癌细胞MCF-7,设置实验组和对照组,用不同浓度的β-榄香烯处理实验组MCF-7细胞。采用MTS法、克隆形成实验和羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色法检测细胞增殖,在流式细胞仪(Beckman Coulter)上检测乳腺癌细胞周期,Hoechst 33258染色法检测MCF-7细胞凋亡形态及荧光强度,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化,Annexin V/PI双染色法检测β-榄香烯对乳腺癌细胞凋亡率变化,Western blot法检测Cleaved Caspase-9、Caspase-9、Cleaved Caspase-7、Caspase-7、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin D3、CDK2、CDK4、CDK6、p18、p21、p27、LOX、mTOR和p-mTOR蛋白在乳腺癌细胞MCF-7中表达水平。结果:1β-榄香烯对乳腺癌移植瘤生长的影响1.1β-榄香烯对MCF-7裸鼠移植瘤体积、重量及抑瘤率的影响模型组裸鼠体重先增加后降低,给药组体重一直在增加。给药组与模型组间体重无显著差别,说明β-榄香烯对裸鼠体重影响不大;给药组的肿瘤体积均小于模型组,且差异具有统计学意义(p<0.05)。肿瘤质量抑制率结果显示,与模型组比较,β-榄香烯(50mg/kg)对MCF-7裸鼠移植瘤的质量抑制率为76.17%,β-榄香烯(100mg/kg)抑制率为83.17%,阳性对照组抑制率为71.58%。1.2β-榄香烯对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤增殖的影响HE染色结果显示,与模型组相比,β-榄香烯(50,100mg/kg)肿瘤组织坏死灶显著增加,胞浆淡染,其中β-榄香烯(100mg/kg)效果最为显著,阳性对照组与β-榄香烯(50mg/kg)次之。Ki-67结果显示,与模型组相比,阳性对照组和β-榄香烯(50,100mg/kg)组肿瘤组织中阳性细胞数量减少,Ki-67表达明显降低。1.3β-榄香烯对人乳腺癌细胞移植瘤凋亡的作用TUNEL染色结果显示,与模型组相比,β-榄香烯(50,100mg/kg)可以显著增加绿色荧光细胞数量,细胞荧光强度越来越强,并且乳腺癌细胞显现出凋亡形态,这些结果表明β-榄香烯可以诱导MCF-7异种移植瘤的细胞凋亡。1.4β-榄香烯对MCF-7细胞LOX、Cyclin D1和p-mTOR蛋白表达的影响免疫组织化学分析显示,与模型组相比,β-榄香烯(50,100mg/kg)显著降低LOX和Cyclin D1蛋白的表达。免疫荧光法显示,β-榄香烯降低了肿瘤细胞中p-mTOR蛋白的水平。这些结果表明β-榄香烯能抑制LOX和Cyclin D1蛋白的表达,抑制mTOR蛋白磷酸化。2β-榄香烯对人乳腺癌细胞MCF-7的作用2.1β-榄香烯对MCF-7细胞增殖的影响人乳腺癌细胞MCF-7经过不同浓度β-榄香烯(50,100,200,300,400μmol/L)处理,并于24、48、72h后应用于MTS试验。结果显示,β-榄香烯对MCF-7细胞活力的抑制作用呈剂量和时间依赖性。β-榄香烯浓度为400μmol/L,时间为72h时,抑制作用最显著。克隆形成实验结果显示,随着β-榄香烯(100,200,300μmol/L)浓度的增加,β-榄香烯显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7克隆形成(p<0.05)。CFDA-SE染色法显示,与空白对照相比,随着β-榄香烯(100,200,300μmol/L)浓度增加,细胞荧光强度也逐渐增强。2.2β-榄香烯促进MCF-7细胞凋亡相对于空白对照组,随着β-榄香烯浓度(100,200,300μmol/L)的增加,一些MCF-7细胞的细胞核变得破碎,核染色质浓缩,β-榄香烯促进了MCF-7细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,降低了细胞线粒体膜电位,β-榄香烯(100,200,300μmol/L)增加凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-9和Bax的表达水平,降低凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9和Bcl-2的表达水平,促进了Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9蛋白发生剪切,这些结果表明,β-榄香烯能够诱导人乳腺癌细胞发生凋亡。2.3β-榄香烯对人乳腺癌细胞MCF-7周期的影响相对于空白对照组,随着β-榄香烯浓度(100,200,300μmol/L)的增加,β-榄香烯以浓度依赖的方式显著增加了MCF-7细胞在G2/M期的比例,表明β-榄香烯使乳腺癌细胞MCF-7细胞周期阻滞于G2/M期。与空白对照组比较,β-榄香烯(100,200,300μmol/L)降低了周期相关蛋白CDK6、Cyclin D1、Cyclin D3、p18、p21和p27的表达水平,而CDK4蛋白表达升高。但CDK2蛋白的水平没有显著变化,这些结果表明β-榄香烯能将乳腺癌细胞MCF-7周期阻滞在G2/M期。2.4β-榄香烯对MCF-7细胞LOX、p-mTOR和mTOR蛋白表达的影响相对于空白对照组,随着β-榄香烯(100,200,300μmol/L)浓度的增加,p-mTOR和LOX蛋白的表达水平下降,mTOR总蛋白无显著变化,这些结果表明β-榄香烯能下调LOX蛋白水平,抑制mTOR蛋白的磷酸化表达。结论:β-榄香烯可以显著抑制裸鼠体内乳腺癌异种移植瘤的生长,其抗肿瘤作用可能与β-榄香烯抑制增殖和诱导凋亡相关。β-榄香烯抑制体外人乳腺癌细胞MCF-7增殖,诱导乳腺癌细胞凋亡和周期阻滞的发生,体内体外实验均表明β-榄香烯对乳腺癌的治疗作用与降低LOX和Cyclin D1蛋白水平以及抑制乳腺癌细胞mTOR磷酸化有关。