棕榈酰基转移酶(Palmitoyl Transferases,PATs)是植物中一类重要的蛋白质翻译后修饰酶,在蛋白质棕榈酰化修饰过程中发挥着关键的作用。研究表明,PATs在真核生物中具有广泛的细胞功能,对植物的生长发育、器官形成、生殖发育及胁迫响应等生命活动具有重要的调控作用。因此,PATs功能的发掘为植物株型构建、增产增收以及品质改良等分子设计育种工作提供了新的研究思路和基因资源。目前,我国梨栽培生产中还没有有效的梨矮化砧木,探索分析梨中具有矮化潜力的PATs功能,有助于揭示砧木矮化机理,对加快我国梨产业现代化转型升级,实现矮化栽培模式具有重要的意义。本研究利用生物信息学方法对编码PATs蛋白的梨PbDHHC基因家族进行了分析鉴定,以杜梨(Pyrus betulifolia)为研究试材,利用CRISPR/Cas9基因编辑对PbPAT14基因进行敲除获得杜梨矮生突变体,从生长指标、微观结构、内源激素含量、基因表达模式以及互作蛋白筛选等角度对杜梨突变体进行深入剖析,旨在阐释杜梨矮生突变体的矮生机理,为进一步揭示砧木矮化机理提供理论依据。主要研究结果如下:1、全基因组水平从梨(Pyrus bretschneideri ’Dangshansuli’)测序数据中鉴定到36个完整的PbDHHCs基因,命名为PbDHHC1～PbDHHC36。该基因家族氨基酸序列平均长度为456 aa,蛋白分子量从27659.82 Da到79207.72 Da,等电点从5.22到9.78,80%的PbDHHCs编码蛋白中包含4个跨膜结构域。基因定位显示,26个PbDHHCs基因定位到14条染色体上,并呈现出不均匀的分布形式。根据同源进化关系,可将PbDHHC基因家族分为A～G共7个亚组,其中每个亚组的PbDHHCs在基因结构和结构域相位分布上表现出较高的一致性,进一步支持了同源分组关系的准确性。基因启动子分析发现,PbDHHCs基因上游存在着大量与生长发育和激素应答相关的顺式作用元件,说明梨PbDHHCs基因在转录过程中可能具有十分复杂的调控模式。基因表达模式分析表明,89%的PbDHCs基因在不同组织器官中均有表达值,并且表现为组成型表达模式,说明PbPATs在梨中具有十分广泛的生物功能。2、利用Trizol方法、CTAB方法和试剂盒方法常见的三种植物总RNA提取方法,系统性分析对比各个方法提取的杜梨不同组织(根、茎、叶、花和果实)总RNA的质量。结果表明,三种方法均可以从杜梨各个组织中提取出总RNA,但是不同方法提取的总RNA浓度和质量相差较大。三种方法提取的果实总RNA浓度相较于其他组织较低,CTAB方法提取的杜梨各个组织总RNA浓度高于其他方法,试剂盒方法提取的杜梨各个组织总RNA纯度最好。电泳检测结果表明,三种方法提取的总RNA均不同程度的遗漏了小分子5S RNA,其中Trizol方法和CTAB方法最为明显,并且均存在不同程度的拖尾现象。3、梨中假定的PbPAT14-1和PbPAT14-2基因编码序列长度分别为921 bp和906 bp,两者的基因结构十分相似均有7个外显子和6个内含子构成,但两者的基因全长差异较大,分别为5822 bp和3324 bp,说明这两个基因可能来自不同的祖先或者在进化过程中丢失片段差异较大。另外,PbPAT14-1和PbPAT14-2与拟南芥AtPAT14的氨基酸序列同源相似度分别为83%和70%。体内互补试验表明,PbPAT14-2可以挽救酵母AKR1 PAT功能缺失突变体akr1的生长缺陷,同时还可以恢复拟南芥突变体atpat14的矮生表型,说明PbPAT14-2蛋白具有PATs酶活性,而PbPAT14-1蛋白并没有表现出PATs酶活性。氨基酸点突变试验结果显示,将PbPAT14蛋白中DHHC保守结构域上的半光氨酸突变为丝氨酸后,PbPAT14-DHHC148S并不能恢复酵母突变体akr1的生长缺陷,说明PbPAT14蛋白的酶活性位点为DHHC保守结构域中的半光氨酸残基。Acyl-RAC试验结果表明,PbPAT14蛋白具有自身棕榈酰化的功能。4、根据PbPAT14基因序列,筛选到三个特异性较强打靶位点PbPAT14-T1、PbPAT14-T2和PbPAT14-T3,并构建植物CRISPR/Cas9融合表达载体。以杜梨种子子叶为试材,利用农杆菌转化方法,共获得22株转基因杜梨苗,其中6株具有矮生黄化表型。测序结果显示,矮生黄化植株中T2和T3靶点序列发生了基因编辑事件。单克隆测序分析表明,靶点区域产生的突变类型为单碱基或小片段的缺失和插入,并且不同的sgRNA表达盒在各个靶点表现出不同的编辑效率,分别为0%、86.3%和68.1%。脱靶位点测序结果表明,潜在的三个脱靶位点区域均没有发生基因编辑。5、生长指标测定结果表明,野生型杜梨的平均株高大约为杜梨突变体的3倍,分别为3.01 cm和1.09 cm;野生型叶片数量大约为突变体的2倍,分别为19和11;野生型杜梨和突变体在叶片面积上没有表现出显著性差异。另外,野生型杜梨叶片的叶绿素含量大约是突变体的2.5倍,分别为1.63 mg/g和0.67mg/g。微观结构观察发现,杜梨突变体的茎直径显著小于野生型,但是茎组织细胞(包括皮层细胞和髓细胞)的长度和宽度均没有表现出显著性差异,说明杜梨突变体的矮生性状与细胞数量有关,与细胞大小并无直接关系;杜梨突变体叶片厚度(包括栅栏组织和海绵组织)明显小于野生型。内源激素测定结果表明,杜梨突变体中ABA含量明显高于野生型,并且ABA代谢通路中相关基因的表达量同样存在显著性差异,说明梨中PbPAT14蛋白所修饰的底物可与ABA代谢通路相关。6、根据杨树(Populus trichocarpa)细胞中鉴定的棕榈酰化蛋白,筛选得到与ABA代谢通路相关的棕榈酰化蛋白CPKs。通过同源比对,从梨基因组中找到5个同源的 PbCPKs 基因,分别为 PbCPK1、PbCPK6、PbCPK13、PbCPK21 和 PbCPK30。棕榈酰化修饰位点预测软件CSS-Plam分析结果表明,这些PbCPKs蛋白中包含1 1个棕榈酰化修饰位点,说明PbPAT14蛋白的修饰底物可能为PbCPKs,为进一步揭示PbPAT14棕榈酰化修饰分子机制提供了线索。