论文部分内容阅读
在人体内,羧酸酯酶是一类分布广泛的酶,能催化许多内源性和外源性物质的水解,与药物代谢和脂肪变性密切相关,如催化奥司他韦、氯吡格雷、艾司洛尔等前药的水解,其水解活性在药物保护和新陈代谢方面发挥了非常重要的作用。然而,人体内羧酸酯酶水平的代谢异常或者缺失会诱发高血脂症、脉粥样硬化、甚至癌症等疾病。因此,对羧酸酯酶水平的检测研究具有重要的药理学和临床应用意义。现存的羧酸酯酶检测方法中,荧光检测法因其具有选择性好、灵敏度高、操作简单和对生物体无破坏性等优点,广泛应用于生物、医学、化学和材料等领域中。本文设计合成了一例基于分子内电荷转移(ICT)原理的羧酸酯酶比率型双光子荧光探针。该探针以吡喃腈类染料(dicyanomethylene-4H-pyran chromophores,DCM)为荧光团,引入荧光淬灭剂乙酸苯甲酯甲氧基形成了一个酰胺键和酯键,当羧酸酯酶存在时,使探针发生水解反应,末端羧酸酯键断裂,裸露出的4-羟基苯甲醇不稳定,发生1,6-消除反应使氨基甲酸酯断裂,释放出DCM染料分子增强荧光信号,从而达到检测羧酸酯酶的目的。本文研究工作和主要结论如下:(1)成功制备了具有ICT效应的比率型双光子荧光探针DCM-CE,通过1H-NMR和MS分别对中间产物与最终产物的结构进行表征,证明其化学结构的正确性。(2)光谱测试结果表明,探针在PBS/DMSO缓冲液的测试体系(v/v,4:1)中,用470 nm的光激发,在606 nm处有最大发射峰;加入羧酸酯酶后,666 nm处的荧光信号增强,而606 nm处荧光强度降低,发生60 nm的红移,可实现对羧酸酯酶的比率型荧光检测。与羧酸酯酶反应前后,体系颜色由浅黄色变为无色,肉眼可见。另外,探针对羧酸酯酶的响应较快(30分钟内),选择性较好,抗干扰性较强,在3.0-10.0的pH范围内稳定性好。(3)细胞测试结果表明,该探针具有良好的细胞膜通透性、低毒性,能被细胞很好的摄取,成功应用于活细胞内羧酸酯酶的单光子和双光子荧光成像,能实时监测细胞内羧酸酯酶活性。因此,探针DCM-CE在药物研发和脂肪变性等生物医学方面具有潜在的应用价值。