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前言:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,它的发生是由多基因改变、多种因素参与、并经历了多步骤的渐进过程,癌基因、抑癌基因、DNA错配修复基因、细胞黏附分子、端粒/端粒酶、细胞周期调节因子和生长因子/受体系统等多个基因改变的积累参与了由正常上皮细胞转变成胃癌的过程。端粒保护蛋白（protection of telomeres,POT1）是美国科学家Peter Baumann等人于2001年在人和裂殖酵母中发现的一种端粒单链结合蛋白,近年来的研究表明,它对于端粒长度的调控以及染色体的稳定有着非常重要的作用,其表达水平下降或者功能异常会引起端粒功能的降低以及染色体畸变,与人类细胞的老化和恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。为进一步研究人端粒保护蛋白（human protection of telomeres,hPOT1）在胃癌中表达水平的变化及其与胃癌发生发展的关系,我们采用免疫组织化学染色的方法对57例胃癌手术切除标本和10例正常胃粘膜标本中hPOT1的表达水平进行了检测,通过正、反义基因转染技术,观察了hPOT1蛋白表达水平的变化对胃癌细胞生长增殖及凋亡的影响,结果发现在胃癌组织中hPOT1的表达水平明显增高,降低胃癌细胞中hPOT1的表达水平,可抑制胃癌细胞的生长增殖,为进一步研究hPOT1的生物学功能及其与胃癌发生、发展的关系提供了新的实验依据。【目的】研究hPOT1蛋白在胃癌中的表达水平及其临床意义,观察hPOT1蛋白表达水平变化对SGC7901胃癌细胞生长、增殖的影响,希图进一步提示hPOT1蛋白与胃癌发生、发展的关系。【方法】1)采用sP免疫组化方法检测hPOT1在57例胃癌标本中的表达,同时以10例正常胃粘膜标本做对照:2)采用分子克隆技术构建hPOT1基因的正、反义真核表达载体,并经过PCR、酶切、测序鉴定;3)采用新一代聚阳离子脂质体LipofectAMINTM2000作为载体,将hPOT1基因的正、反义真核表达载体转染入人胃癌细胞SGC7901内,以转染空载体和未转染的细胞做对照,经G418筛选形成细胞克隆;4)采用PCR扩增外源性NeoR基因的方法鉴定外源基因在细胞内的表达:5)采用Westernblot测定hPOT1蛋白的表达变化;6)采用MTT法检测细胞生长曲线;7)采用流式细胞仪测定细胞周期;8)采用流式细胞仪测定细胞凋亡;9)采用电子显微镜观察转染细胞形态学改变;【结果】1)57例胃癌标本的表达全阳性,阳性率100%,显著高于正常胃粘膜hPOT1的表达（40%）。浸润至或超过浆膜层的胃癌hPOT1表达强度显著高于未达浆膜层者,Ⅲ/Ⅳ胃癌明显高于Ⅰ/Ⅱ期胃癌,低分化胃癌高于高分化胃癌（P＜0.05）。2)PCR、酶谱分析及DNA测序结果表明hPOT1正、反义真核表达载体序列和方向正确,并分别命名为pcDNA-s-hPOT1和pcDNA-as-hPOT1;3)通过脂质体介导的基因转染法,分别将hPOT1的正义基因真核表达载体（pcDNA-s-hPOT1）、反义核酸真核表达载体（pcDNA-as-hPOT1）、空载体转入SGC7901胃癌细胞,经G418筛选,获得细胞阳性克隆,分别命名为SGC7901s,SGC7901as,SGC7901neo;4)具有G418抗性的SGC7901s、SGC7901as、SGC7901neo细胞均能扩增产生276 bp NeoR基因片段,而SGC7901细胞扩增阴性;5)与SGC7901、SGC7901neo和SGC7901s细胞相比,SGC7901as细胞hPOT1蛋白表达降低（P＜0.05）,细胞增殖速度减慢;6)流式细胞仪测定细胞周期发现,与SGC7901、SGC7901neo和SGC7901s细胞相比,SGC7901as细胞S期细胞明显减少,G2/M期细胞增加,细胞凋亡率明显增加（15.28±0.8%vs1.84±1.3%,1.93±1.6%,1.75±0.6%,P＜0.05）,而SGC7901s、SGC7901neo细胞与SGC7901细胞相比变化不大;7)电镜观察发现:转染hPOT1反义基因的细胞SGC7901as出现凋亡改变,电子密度变深,胞浆浓缩,细胞核固缩,染色质浓集成团,染色体边集成块状或环状;【结论】本研究发现hPOT1在胃癌组织中表达异常增高,并与胃癌的分化程度、浸润深度及TNM分期密切相关。同时成功地构建了hPOT1基因正反义真核表达载体,并将其稳定转染至人胃癌SGC7901细胞中,证明hPOT1反义真核表达载体可降低细胞hPOT1蛋白的表达,使细胞增殖减慢,S期细胞明显减少,G2/M期细胞增加,凋亡增加。为进一步揭示了hPOT1蛋白的生物学功能及其与胃癌发生、发展的关系提供了新的实验依据。