病毒性乙型肝炎已经成为一个全球性的严重的公共卫生问题。α干扰素(IFN-α)已被证实对治疗乙型肝炎有效,然而持续有效的治疗效果只在1/3的乙型肝炎病人中出现。有关IFN-α的作用机制,目前还未完全清楚。由于对基因认识能力和系统的研究工具的缺乏,乙型肝炎病毒(HBV)感染后,宿主细胞抗病毒效应的产生、作用机制以及与病毒复制表达的关系仍不清楚,甚至HBV在体内复制的机制也未能完全明了。为了研究HBV感染和IFN-α作用下宿主细胞基因表达的改变、了解HBV病毒复制和宿主抗病毒机制之间相互作用关系、探讨在IFN-α作用下,宿主细胞基因表达抑制HBV复制的作用机理,本研究借助一个点有14,000个人类基因的cDNA微点阵膜来研究有HBV复制的HepG22.2.15细胞和其来源母细胞HepG2细胞在IFN-α(5×103IU/ml)处理前及处理后6小时、24小时和48小时的细胞基因表达谱的改变情况。使用ArrayGauge软件对杂交和扫描后获得的数据进行分析,并从所得数据中挑出部分细胞基因作RNA slot分析,以验证微点阵分析结果的准确性。通过对细胞mRNA表达变化情况的分析发现,在IFN-α处理之前,HepG22.2.15细胞与HepG2细胞相比就已经有89个细胞基因有3倍以上的表达差异,其中14个已知基因下调改变,7个已知基因上调改变,其余均为未知基因,提示这些基因可能与HBV整合、复制和表达对细胞的影响等有关。IFN-α处理6小时后,HepG22.2.15细胞与HepG2细胞中分别有34、83个基因表达发生3倍以上的上下调改变,24小时后则分别达到48和103个。约有半数发生表达改变的细胞基因为功能已知基因,依据其功能可分为干扰素相关基因、细胞信号传导、激酶、磷酸化及配体受体结合相关基因等几大类;其它则大多为新的细胞基因或EST,对后者的深入研究将有助于进一步完善干扰素作用机制及发现新型抗病毒药物的作用位点。为进一步研究IFN-α、HBV复制与细胞基因之间的关系,从细<WP=5>胞基因表达谱中挑出了23个基因,分析IFN-α处理对上述基因在两株细胞中表达的影响。结果显示,IFN-α处理后,在HepG22.2.15细胞内,3个在IFN-α处理前即表达受抑制的基因,在IFN-α处理后表现为上调,它们分别是血管表皮生长因子(AF022375)、酪氨酸磷酸酶1E(U12128)、丝氨酸蛋白酶IGF结合基序(D87258),提示这些被HBV复制所抑制的基因在IFN-α作用下表达有所恢复。而2个IFNs诱导的激酶基因和2个原癌基因则在IFN-α作用下表现为继续下调表达,表明IFN-α治疗不能逆转病毒复制对细胞基因的影响。通过cDNA微点阵分析还发现,一个新的干扰素相关基因——ISG12在HepG2和HepG22.2.15细胞中均受IFN-α诱导而显著上调表达,并成为表达上调幅度最大的基因之一。鉴于目前ISG12的功能还不清楚,为了进一步明确ISG12与IFN-α和HBV三者之间的关系,先使用Northern blot分析了IFN-α作用下HBV mRNA和ISG12的表达变化,结果显示在HepG22.2.15细胞中,ISG12在IFN-α处理后6小时即开始上调表达,而HBV则在IFN-α处理6小时后复制明显受到抑制,两者在时间上具有相关性。随后,构建了一个能在真核表达系统中表达的pcDNA3.1/ISG12-HA质粒,通过一系列的瞬时共转染实验表明,ISG12的表达能减少HBsAg和HBeAg的表达,且这种抑制作用有剂量依赖关系。实时荧光定量PCR分析结果表明,细胞中HBV mRNA的含量在ISG12表达时为不表达时的33%,而HBV核心颗粒中DNA的量在ISG12表达时只有不表达时的2.7%,证明ISG12对HBV抗原表达的抑制作用源于对HBV转录和翻译的抑制。虽然目前尚不清楚ISG12抑制HBV复制的具体机制,但在上述研究基础上更深一步的机制探讨,能全面揭示ISG12的功能、HBV复制机制以及完善IFN-α代谢通路,最终使在分子水平上寻找新型抗病毒药物的靶位点成为可能。