研究背景和目的胃上皮下病变是临床上内镜检查的常见疾病,由于其缺乏特异性的临床表现和实验室检查指标,常在患者进行胃镜检查时偶然发现。胃上皮下病变的病理组织学类型多样,一般可分为非肿瘤性病变和肿瘤性病变(包括良性肿瘤性病变、潜在恶性肿瘤性病变和恶性肿瘤性病变),其生物学行为表现差异极大。胃上皮下病变的胃镜下表现极其相似,通常表现为被覆正常组织粘膜的半球形或球形的隆起型病变。因而,仅仅依靠普通白光内镜检查难以对胃上皮下病变进行准确的诊断。超声内镜(endoscopic ultrasound,EUS)检查是临床上评估胃上皮下病变的最常用手段之一。通过白光内镜和超声的有效结合,EUS可以充分评估胃上皮下病变的病变部位、大小、起源层次、形状、边缘以及回声强度等情况。但EUS检查后无法获取病变的病理组织学标本,其对胃上皮下病变的诊断准确率仅能达到45.5%～66.3%。近年来,多种先进内镜技术如EUS引导下细针抽吸活检术(EUS-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)和EUS 引导下Trucut穿刺活检术(EUS-guided trucut biopsy,EUS-TCB),亦被广泛用于胃上皮下病变的诊断。这些内镜技术希望通过对病变的穿刺活检获取组织标本,从而实现对病变的病理组织学诊断,弥补EUS对胃上皮下病变形态学诊断的不足。然而,既往研究发现,EUS-FNA对胃上皮下病变的组织获取率为38%～82%,无法取得理想的病理组织学诊断;而EUS-TCB虽然可以获取更多的组织标本,但由于设备自身的缺陷(如穿刺组织所需的角度较大时,外切鞘管不易弹出),使得EUS-TCB具有较高的穿刺失败率。细针型共聚焦激光显微内镜(needle-based confocal laser endomicroscopy,nCLE)是近年来共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy,CLE)技术的新发展,不同于探头式CLE应用于消化道粘膜浅表性病变的诊断,nCLE能够在常规EUS检查的同时,经由19 G穿刺针穿刺进入病变部位(粘膜深层或深部脏器组织),在体实时显示病变组织的显微结构变化,从而对病变进行诊断,实现“光学活检”。目前已有将nCLE用于胰腺囊性病变、胰腺实性病变、恶性淋巴结诊断的研究报道,但该技术用于胃上皮下病变的诊断尚无相关研究。在CLE对病变进行成像诊断时,这种新型的内镜技术会成像出类似病理组织学图像的黑白影像结果,这种图像特征要求内镜医师必须具备一定的病理组织学知识才能更好地掌握CLE图像诊断。此外,内镜医师在长时间进行操作检查后容易发生视觉疲劳,也将可能导致漏诊和误诊的发生。因此,如何有效地减轻内镜医师对nCLE的学习负担,快速、准确地对nCLE图像进行诊断,将成为进一步临床应用nCLE诊断胃上皮下病变亟需考虑的问题。而随着计算机技术的不断革新和迅猛发展,基于深度学习的人工智能在图像识别方面展现出了广阔的应用前景。目前,已有多项临床研究致力于将深度学习应用于医学图像识别领域,如病理切片图像识别、影像学图像识别、消化内镜图像识别等。因此,本研究围绕胃上皮下病变的显微内镜诊断及其深度学习辅助诊断方面展开研究,主要研究目的如下所述:(1)探究nCLE在深部脏器组织中的成像特点,初步评估nCLE诊断应用的可行性;(2)通过对各类胃上皮下病变的nCLE图像和其相应的病理组织学图像的比对分析,总结各类胃上皮下病变的nCLE图像特征,建立胃上皮下病变nCLE诊断标准;利用上述制定的nCLE诊断标准,前瞻性评估nCLE实时诊断胃上皮下病变的诊断价值;同时系统地评估nCLE诊断胃上皮下病变的可行性、安全性和可靠性;(3)构建用于辅助内镜医师诊断胃上皮下病变nCLE图像的深度学习模型,评估深度学习模型诊断胃上皮下病变的应用价值。研究方法第一部分:细针型共聚焦激光显微内镜在体成像的动物实验研究选取健康日本大耳白兔为实验动物,实验兔经耳缘静脉推注3%戊巴比妥钠溶液(1 ml/kg)麻醉后取仰卧位固定于兔台上。沿实验兔腹部做正中切开,充分暴露腹腔脏器组织。利用构建的nCLE穿刺模型分别对实验兔的大网膜、肝脏、胰腺、腰大肌进行穿刺成像,观察各腹部脏器组织的nCLE成像特征并保存清晰的nCLE图像。待上述所有脏器组织nCLE成像结束后,留取nCLE穿刺成像部位的组织标本。由3名有经验的显微内镜医师与1名消化系统病理学专家组成专家小组对各扫描部位nCLE图像与相应部位组织标本的病理组织学图像进行非盲法比对分析,评估nCLE在各腹部脏器组织中的成像特点。第二部分:细针型共聚焦激光显微内镜在胃上皮下病变诊断中的临床应用研究本部分研究共分为2个研究阶段,分别为第一阶段先期临床研究和第二阶段临床验证研究。1)第一阶段先期临床研究2016年5月至2016年11月,根据纳入标准和排除标准,前瞻性纳入经胃镜检查发现胃上皮下病变(大小≥2 cm)拟行EUS检查的患者。由1名有经验的内镜医师首先对胃上皮下病变进行常规EUS检查并评估,然后行EUS引导下nCLE检查,同时图像采集系统采集完整nCLE视频信息。所有患者在全部内镜检查结束后均接受内镜治疗或外科手术治疗。所有病变的最终诊断以病理组织学结果为金标准。由3名有经验的显微内镜医师和1名消化系统病理学专家组成专家小组,通过对nCLE图像与相应病变组织标本的病理组织学图像进行非盲法比对分析,总结各类胃上皮下病变的nCLE图像特征,最终建立胃上皮下病变(包括胃肠间质瘤、异位胰腺、平滑肌瘤、癌)nCLE诊断标准。2)第二阶段临床验证研究2016年12月至2018年4月,根据纳入标准和排除标准,前瞻性纳入经胃镜检查发现胃上皮下病变(大小≥1 cm)拟行EUS检查的连续患者。由1名有经验的内镜医师首先对胃上皮下病变进行常规EUS检查并做出初步EUS诊断,然后根据第一阶段先期临床研究制定的nCLE诊断标准对胃上皮下病变进行nCLE实时诊断,同时图像采集系统采集完整nCLE视频信息。内镜检查结束后,评估操作相关的不良事件。以内镜切除或外科手术切除标本的病理组织学结果为金标准,评估nCLE对胃上皮下病变进行实时诊断的诊断效能。1个月后,该内镜医师再次对所有病变的nCLE视频进行事后诊断。为评估观察者间一致性和nCLE图像质量,所有nCLE视频被随机分配给3名未参与实时诊断的显微内镜医师进行盲法诊断和图像质量评分(5点量表评分法;图像质量差:1分;图像质量一般:2分;图像质量中等:3分;图像质量好:4分;图像质量极好:5分)。第三部分:深度学习模型在细针型共聚焦激光显微内镜诊断胃上皮下病变中的应用研究从山东大学齐鲁医院消化内镜中心图像数据库选取2016年3月至2018年6月期间的胃上皮下病变nCLE图像。将所选取的nCLE图像进一步分为训练集图像、验证集图像和测试集图像。3名有经验的显微内镜医师以病理组织学结果为金标准,结合胃上皮下病变nCLE诊断标准,将所有nCLE图像分成梭形细胞肿瘤(包括胃肠间质瘤和平滑肌瘤)、异位胰腺和癌3大类进行人工标注。算法工程师把标注好的nCLE图像进行图像裁剪、图像缩小、数据归一化、白化等一系列图像预处理,以便更好地展现nCLE图像特征。利用Inception ResNet V2卷积神经网络构建深度学习模型。训练集图像和验证集图像用于深度学习模型的训练。训练完成后,测试集图像用于测试经训练得到的深度学习模型,评估深度学习模型对nCLE图像分类的诊断效能。同时,邀请2名有经验的显微内镜医师分别独立地对上述同一测试集图像进行盲法分类诊断,并记录其完成所有测试集图像诊断所需的时间。研究结果第一部分:细针型共聚焦激光显微内镜在体成像的动物实验研究本部分研究共纳入5只实验兔(雄兔3只,雌兔2只),所有实验兔均成功完成nCLE成像。nCLE成像清晰显示了大网膜、肝脏、胰腺和腰大肌的细胞形态、腺体结构以及微血管等显微结构。各腹腔脏器组织的nCLE图像具有特征性表现,并与病理组织学图像保持良好的一致性,具体如下:1)大网膜:nCLE成像表现为大小一致、排列规则、较透亮、圆形或类圆形的细胞结构,细胞间因相互重叠而呈现出立体感,其间可见白色血管结构;2)肝脏:nCLE成像表现为规则放射状排列的黑色索状结构,其间可见白色条索样血管,血管内有黑色小颗粒样结构流动;3)胰腺:nCLE成像表现为腺泡形态饱满,呈圆形或多边形,大小一致,排列规则;黑色腺泡结构间可见网状结构血管;4)腰大肌:nCLE成像在纵切面中肌纤维呈宽度一致、黑色、长条带状结构,肌纤维间可见白色血管结构;而在横切面中肌纤维呈粗细均匀、排列规则的类圆形或多边形结构,可见黑色线性轮廓。第二部分:细针型共聚焦激光显微内镜在胃上皮下病变诊断中的临床应用研究1)第一阶段先期临床研究本阶段研究最终纳入33名患者(男/女:14/19;平均年龄:55.6±11.2岁),共有33处胃上皮下病变(平均大小:3.9±3.1 cm)。所有患者均成功进行EUS引导下nCLE检查。在内镜检查结束后,20例病变经内镜治疗完整切除;其余13例病变进行外科手术切除。最终病理组织学诊断结果显示,胃肠间质瘤14例(极低或低风险9例,中等或高风险5例)、异位胰腺8例、平滑肌瘤6例、癌5例(低分化腺癌[内镜活检阴性的可疑革囊胃]4例,转移癌1例)。专家小组通过对nCLE图像与相应病变组织标本的病理组织学图像进行比对分析,制定出胃上皮下病变nCLE诊断标准,如下所述:1)a,胃肠间质瘤(极低或低风险):致密、浅灰的束状结构,无腺体成分;血管增多伴轻度荧光素钠渗漏;b,胃肠间质瘤(中等或高风险):异质性的束状结构;扩张迂曲的血管伴异质性荧光素钠渗漏;2)异位胰腺:规则的黑色小叶状结构,呈“咖啡豆样”外观;规则的网状结构血管;3)平滑肌瘤:均质、疏松、深灰色交织或束状结构,无腺体成分;血管增多,无荧光素钠渗漏;4)癌:异型腺体/不规则、黑色细胞聚集;扩张迂曲的血管伴异质性荧光素钠渗漏。2)第二阶段临床验证研究本阶段研究最终纳入61名患者(男/女:25/36;平均年龄:54.1±11.0岁),共有61处胃上皮下病变(平均大小3.0±2.6 cm)。除1名患者因穿刺失败而无法进行nCLE成像外,60名患者成功完成EUS引导下nCLE检查,且无操作相关不良事件发生。以内镜切除(35例)或外科手术切除(26例)标本的病理组织学诊断为金标准,61例胃上皮下病变中包括胃肠间质瘤19例(极低或低风险13例,中等或高风险6例)、异位胰腺17例、平滑肌瘤13例、癌12例。在12例癌中,8例为内镜活检阴性的可疑革囊胃(最终病理组织学诊断为低分化腺癌),2例为隆起型病变表现的低分化腺癌,2例为隆起型病变表现的转移癌。根据第一阶段先期临床研究制定的胃上皮下病变nCLE诊断标准,nCLE对胃肠间质瘤实时诊断和事后诊断的敏感性、特异性和准确度分别为73.7%vs.84.2%、95.1%vs.95.1%和88.3%vs.91.7%;对异位胰腺实时诊断和事后诊断的敏感性、特异性和准确度分别为100.0%vs.100.0%、97.7%vs.100.0%和98.3%vs.100.0%;对平滑肌瘤实时诊断和事后诊断的敏感性、特异性和准确度分别为91.7%vs.83.3%、93.8%vs.93.8%和93.3%vs.91.7%;对癌实时诊断和事后诊断的敏感性、特异性和准确度分别为83.3%vs.100.0%、95.8%vs.97.9%和93.3%vs.98.3%;其比较结果均无统计学差异(P>0.05)。此外,nCLE实时诊断在诊断各类胃上皮下病变的准确度以及总体准确度方面均显著高于EUS诊断,其比较结果具有统计学差异(胃肠间质瘤,88.3%vs.70.0%,,P=0.01;异位胰腺,98.3%vs.81.7%,P<0.0l;平滑肌瘤,93.3%vs.75.0,P=0.0 1;癌,93.3%vs.80.0%,P=0.03;总体准确度,86.7%vs.51.7%,P<0.01)。根据5点量表评分法,nCLE图像质量评分为3.6±0.1分。nCLE诊断胃肠间质瘤、异位胰腺、平滑肌瘤和癌的观察者间一致性kappa值分别为0.64、0.95、0.68和0.77。第三部分:深度学习模型在细针型共聚焦激光显微内镜诊断胃上皮下病变中的应用研究本部分研究共收集6628张胃上皮下病变nCLE图像,包括训练集图像4371张、验证集图像1457张、测试集图像800张。而在测试集图像中,梭形细胞肿瘤nCLE图像260张、异位胰腺nCLE图像243张、癌nCLE图像297张。经测试集图像测试,深度学习模型诊断梭形细胞肿瘤、异位胰腺和癌的曲线下面积分别为0.97、0.99和0.95。当以0.33为诊断阈值时,深度学习模型对梭形细胞肿瘤诊断的敏感性、特异性和准确度分别为93.1%、96.7%和95.5%;对异位胰腺诊断的敏感性、特异性和准确度分别为97.9%、98.2%和98.1%;对癌诊断的敏感性、特异性和准确度分别为92.3%、96.4%和94.9%;深度学习模型完成诊断所需时间为34秒。而2名有经验的显微内镜医师(显微内镜医师1和显微内镜医师2)分别独立地对上述同一测试集图像进行分类诊断,其诊断梭形细胞肿瘤的敏感性分别为94.6%和93.9%,特异性分别为95.4%和94.1%,准确度分别为95.1%和94.0%;其诊断异位胰腺的敏感性分别为96.7%和97.5%,特异性分别为98.6%和98.2%,准确度分别为98.0%和98.0%;其诊断癌的敏感性分别为90.6%和88.2%,特异性分别为96.6%和97.0%,准确度分别为94.4%和93.8%;2名有经验的显微内镜医师完成诊断所需时间分别为2147秒和2528秒。除在诊断梭形细胞肿瘤的特异性方面,深度学习模型显著高于显微内镜医师2(96.7%vs.94.1%,P=0.04)外,其他比较结果均无统计学差异(P>0.05)。此外,深度学习模型、显微内镜医师1和显微内镜医师2对胃上皮下病变诊断的总体准确度分别为94.3%、93.8%和92.9%,其比较结果亦无统计学差异(P>0.05);但深度学习模型诊断所需时间仅为有经验的显微内镜医师的1.3%～1.6%(34秒vs.2147秒和2528秒。研究结论1.nCLE在体成像特征与病理组织学图像具有良好的一致性。2.在EUS引导下,nCLE可对胃上皮下病变的显微结构进行清晰成像;胃肠间质瘤、异位胰腺、平滑肌瘤、癌等胃上皮下病变的nCLE图像具有其特征性表现。3.根据制定的胃上皮下病变nCLE诊断标准,nCLE能对胃上皮下病变进行实时、快速、安全地诊断,同时取得较高的准确度。4.通过对nCLE观察者间一致性进行评估,nCLE诊断胃上皮下病变具有良好的可靠性。5.基于深度学习构建的人工智能模型能够快速、准确地对胃上皮下病变nCLE图像进行分类诊断,其诊断效能不劣效于有经验的显微内镜医师,可作为内镜医师诊断胃上皮下病变的辅助诊断手段。研究意义本研究首次利用nCLE对胃上皮下病变进行诊断,证实nCLE可清晰识别胃上皮下病变的细胞形态、腺体结构、微血管等显微结构;利用制定的胃上皮下病变nCLE诊断标准,nCLE可提供实时、准确、安全、可靠地光学病理组织学诊断,从而有利于内镜医师即时制定出相应的治疗随访策略,避免不必要的治疗或贻误病情等情况的发生。同时,本研究初步探索将人工智能应用于nCLE图像识别领域,通过构建深度学习模型,对胃上皮下病变nCLE图像进行分类诊断,证实深度学习模型可在极短时间内准确地诊断胃上皮下病变,其诊断效能不劣效于有经验的显微内镜医师,这种新的诊断手段可进一步用于内镜医师对nCLE的学习培训以及辅助内镜医师在nCLE检查过程中进行临床诊断。