论文部分内容阅读
目的及方法遗传性心肌病在世界范围内发病人群广、危害大,且具有家族遗传性,给人类带来了严重影响。扩张型心肌病发病率约为1/2500,病人的五年生存率不足50%,极易引起心衰、心律失常、中风等。肌球蛋白重链(Myocinheavychain)作为心肌中最丰富的肌节蛋白之一,突变类型主要为错义突变(Missense Mutation),并且这种突变往往被认为导致显性负性效应,最常见的表现形式为肥厚型心肌病,部分表现为扩张型心肌病。但是此基因其他类型的突变,例如截短突变(Truncation Variation)或者无义突变(Nonsense Mutation)等导致的功能缺失型突变(Loss of Function)以及非移码删失突变(Deletion Variation),这些突变的致病性目前并不明确。目前尽管ACMG指南提出肌球蛋白重链的功能缺失型作为遗传性心肌病的有效证据,但是考虑到肌球蛋白重链超过95%的突变类型为错义突变,其他所有类型仅为5%左右,且临床数据很少,同时心肌病具有外显率不完全的特点,我们很难最终确定功能缺失型或删失突变的致病性。肌球蛋白重链与肌联蛋白(TTN)作为细胞肌节蛋白的重要组成部分,TTN基因的截短突变会导致严重的扩张型心肌病,那么肌球蛋白重链的截短突变和删失突变的作用效果如何呢?而且目前并没有关于肌球蛋白重链截短突变和删失突变的动物模型的建立来供我们进一步研究。为了具体阐明肌球蛋白重链截短突变和删失突变的致病性,同时基于叙利亚金黄仓鼠在心血管疾病方面比大、小鼠更加接近人类,我们运用CRISPR/Cas9技术建立了叙利亚金黄仓鼠Myh6基因敲除(截短突变和删失突变)动物模型。我们对野生型(WT)及敲除仓鼠行心脏B超检查,分析其心脏收缩功能同时确定室壁、室间隔的厚度等。随后我们以WT和截短突变为例,处死阳性与野生组仓鼠,比较各组仓鼠的心脏体重比,行HE及Masson等染色,qRT-PCR检验心衰、纤维化指标等。最后对野生型及Myh6截短突变仓鼠腹腔注射具有心脏毒性的化疗药物阿霉素,观察对比各组仓鼠心脏毒性效应。结果使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首次获得了叙利亚金黄仓鼠Myh6基因截短突变和删失突变动物模型,这也是世界上首例Myh6基因截短突变和缺失突变动物模型,并且证明Myh6基因敲除杂合子具有不完全外显的扩张型心肌病症状,包括射血分数降低,心腔扩张,室壁变薄,心肌纤维化等。我们也证明了Myh6截短突变后心肌细胞的肌节结构及线粒体也会发生明显的改变,如肌节缩短,线粒体体积变小等。随后我们使用具有心脏毒性化疗药物阿霉素处理野生型和Myh6截短突变叙利亚仓鼠,发现Myh6截短突变仓鼠对于阿霉素的心脏毒性效应更加敏感,如阿霉素加速Myh6截短突变个体扩张型心肌病症状的出现,导致肌节结构破坏,线粒体功能紊乱等。结论肌球蛋白重链的截短突变和删失突变会导致明显的扩张型心肌病,并且对于阿霉素的心脏毒性效应更加敏感。叙利亚金黄仓鼠Myh6截短突变及缺失突变种系是研究扩张型心肌病的良好动物模型。