【摘 要】
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奶牛乳腺纤维化是一种以细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积和结缔组织过度增生为特征的疾病。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae,S.agalactiae）是导致奶牛慢性乳腺炎的主要病原菌之一,其持续感染引起乳腺结构损伤,进而发展为纤维化,甚至乳腺硬化。本课题为了明确调控ECM降解代谢相关酶在乳腺纤维化的作用,通过研究S.agalactiae
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.31460642）；
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奶牛乳腺纤维化是一种以细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积和结缔组织过度增生为特征的疾病。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae,S.agalactiae）是导致奶牛慢性乳腺炎的主要病原菌之一,其持续感染引起乳腺结构损伤,进而发展为纤维化,甚至乳腺硬化。本课题为了明确调控ECM降解代谢相关酶在乳腺纤维化的作用,通过研究S.agalactiae诱导乳腺纤维化过程中MMPs/TIMPs与uPA系统的表达及其相关通路,以探讨S.agalactiae诱导乳腺纤维化的分子机制。本试验筛选107cfu/m L浓度的热灭活S.agalactiae菌液作用于体外培养的BMFBs,筛选四个时间点（6h、12 h、24 h、48 h）提取细胞的总RNA和总蛋白,通过q PCR、蛋白印迹技术（Western blot）检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、uPA、PAI-1 m RNA和蛋白的表达水平,并通过明胶酶谱试验检测细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性;利用相同方法检测ERK1/2、P38、JNK及其磷酸化水平的表达,添加MAPKs通路抑制剂,通过明胶酶谱试验检测细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性,应用Western blot方法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-1-2及uPA、PAI-1的表达水平。结果表明:热灭活的S.agalactiae对MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、uPA、PAI-1 m RNA的表达均有不同程度的下降趋势,但可上调MMP-2、TIMP-1的m RNA水平;明胶酶谱法检测MMP-2的酶活性较MMP-9的活性明显,且其二者活性在作用48h被明显激活;MMP-2和MMP-9的蛋白水平表达与对照组相比,主要呈先升高后下降的折线型趋势,在作用后期MMP-2还出现了回升趋势;TIMP-1蛋白水平与对照组相比主要呈先下降后上升的趋势,与MMP-9的表达趋势相反,TIMP-2蛋白表达与对照组相比呈上升趋势;uPA和PAI-1的蛋白水平与对照组相比均呈先降低后升高再降低的趋势,均在24h达到峰值,随后呈下降趋势。热灭活S.agalactiae促进BMFBs ERK1/2、P38和JNK m RNA的表达及其磷酸化蛋白的表达,酶谱显示MAPKs（ERK1/2、P38、JNK）特异性抑制剂能够抑制MMP-2/9活性的分泌,且对MMP-9活性的抑制效果较为显著;MAPKs特异性抑制剂减弱S.agalactiae诱导的TIMP-1、-2和PAI-1的表达,且存在抑制剂联合作用的效应。研究表明,热灭活的S.agalactiae诱导BMFBs中MMP-2、MMP-9和TIMP-1、TIMP-2的表达,并激活uPA系统参与调控MMPs的表达及活性;MAPKs信号通路参与调控几种主要的MMPs/TIMPs及uPA/PAI-1的表达。
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