苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)orfl32(ac132)位于由五个同向基因形成的基因簇中(orf129～133)。其同源基因存在于所有已经完成基因组测序的I组a-杆状病毒中,属于晚期表达基因。本实验室在前期研究中发现ac132编码产物定位于出芽型病毒体 BV(budded virus)和包含体源病毒体 ODV(occlusion-derived virus)的核衣壳;其缺失导致感染性的病毒粒子不能有效增殖,多粒包埋性ODV减少;AC132与病毒囊膜蛋白E18和DNA结合蛋白P6.9免疫共沉淀。本文以AC132为研究对象,尝试从蛋白质相互作用的角度,分析AC132与几个相关宿主蛋白和几个AcMNPV病毒蛋白的相互作用,进一步解析AC132的功能。1.AC132互作蛋白基因的酵母双杂交筛查。利用酵母双杂交技术,以ac132为诱饵基因从AcMNPV感染Sf9细胞18小时的cDNA酵母文库中筛查AC132相互作用蛋白基因。经过一系列的筛选,筛查到两种阳性克隆。序列分析结果显示,这两种阳性克隆分别包含天冬氨酸转氨酶和ADP/ATP转移酶同源物编码序列。2.草地贪夜蛾白三烯A4水解酶同源物基因序列校验。本实验室此前从Sf9细胞cDNA文库中筛查出多个包含疑似AC132互作蛋白编码序列的阳性克隆。对这些阳性克隆的序列分析发现,其中的白三烯A4水解酶同源物编码序列与其它已知的白三烯A4水解酶具有较高序列相似度,但在其中间aa1 18处被一个终止密码子TGA隔断,而其同源物在此处为色氨酸密码子TGG。为了检验这种异变的原因,我们从Sf9细胞纯化总RNA,利用5’RACE技术获得该基因转录产物的5’端序列。测序结果显示,其第118位密码子为TGG。3.AC132与其互作蛋白的相互作用位点识别。本实验室此前通过酵母双杂交已从Sf9细胞cDNA文库中筛查出多个疑似AC132相互作用的宿主蛋白基因,包括白三烯A4水解酶(Leukotriene A-4 hydrolase,LTA4H)编号为7号、一种富含半胱氨酸疏水域蛋白基因(Cysteine-rich hydrophobic domain-containing protein 2,CHIC2)编号为 20 号、40S 核糖体蛋白基因(40S ribosomal protein,RP40S)编号69号和蛋白激酶C受体同源物基因(Receptor of activated protein kinase C 1,RACK1)编号 96 号。为了识别 AC132 与这些互作蛋白之间的相互作用位点,分别从AC132 N端和C端编码序列开始对其进行渐进截短,分别将包含AC132全长或截短突变体编码序列的酵母质粒转化的酵母细胞与包含AC132互作蛋白编码序列的质粒转化的酵母菌株分别做回交实验。回交实验表明,AC132与LTA4H,RP40S,RACK1的相互作用位点分别位于其C端aa 111～219、aa 91～219和aa 71～219区段;与CHIC2的相互作用位点位于aa 51～90区段。4.AC132与另外几种病毒蛋白的亚细胞共定位分析。分别将ac132与egfp,AcMNPV e18、e25、vp39、39k和ie1与rep连接,通过Bac-to-Bac系统转座到AcMNPV基因组的polh位点,构成同时表达AC132-EGFP融合蛋白和E18-RFP融合蛋白的重组病毒vAcac132:egfp-e18:rfp、表达AC132-EGFP融合蛋白和E25-RFP融合蛋白的vAcac132:egfp-e18:rfp、表达AC132-EGFP融合蛋白和VP39-RFP 融合蛋白的 vAcac132:egfp-vp39:rfp、表达 AC132-EGFP 融合蛋白和 39K-RFP融合蛋白的vAcae132:egfp-39k:rfp和表达AC132-EGFP融合蛋白和IE1-RFP融合蛋白的vAcac132:egfp-ie1:rfp。将这些重组病毒分别转染Sf9细胞。转染后48h在激光共聚焦显微镜下观察发现:AC132与E18、E25和VP39三种结构蛋白存在明显的共定位。与E18和VP39的共定位发生在核周及细胞质中,核内有少量的共定位;与E25的共定位主要发生在核内。AC132与39K和IE1这两种非结构蛋白没有观察到明显的共定位现象。为了检测AC132的缺失对E18、VP39和39K亚细胞定位的影响,分别将e18-rfp、vp39-rfp和39k-rfp融合基因分别转座到AcMNPV bacmid pMON14272和ac132缺失突变体vAcac132ko 的polh位点构成表达对应的融合蛋白的重组bacmids:vAce18:rfp、vAcvp39：rfp、vAc39k:rfp、vAcac132ko-e18:rfp、vAcac132ko-vp39:rfp 和 vAcac132ko-39k:rfp。在激光共聚焦显微镜下观察,E18-RFP、VP39-RFP和39K-RFP在ac132缺失突变体转染细胞中的亚细胞定位与在对应的野生型bacmid转染细胞中无显著差异,表明AC132可能对E18、VP39和39K的亚细胞定位没有显著影响。5.ac132 缺失突变体ODV丧失口服感染能力。本实验室在此前的研究中发现,ac132缺失体虽然在被转染的Sf9细胞中几乎不产生感染性BV,在High5细胞中只能产生低量BV;但在这两种被转染细胞中都能产生包含病毒粒子的包涵体。为了分析AC132缺失对ODV毒力的影响,我们分别用ac132缺失型重组病毒vAcac132ko-PH、vAcac132ko-gfp-PH和缺失回复型重组病毒vAcac132ko-rep-PH、vACac132ko-rep-gfp-PH 四种 bacmids 分别转染 High5 细胞,在转染 96h后收集细胞,分别饲喂三龄期的甜菜夜蛾幼虫。结果显示,在饲喂病毒6天后,饲喂缺失型病毒的幼虫并没有出现病毒感染症状,而饲喂缺失回复型病毒的虫体均死亡和液化。分别取4种病毒饲喂处理6天后的幼虫血淋巴液在显微镜下观察,结果显示,在vAcac132ko-PH病毒处理的幼虫血细胞中未观察到典型的包涵体,在vAcac132ko-gfp-PH病毒处理的幼虫血细胞中没有观察到绿色荧光。在缺失回复型病毒饲喂的甜菜夜蛾幼虫血细胞中易见包涵体和绿色荧光。将缺失型和缺失回复型bacmids分别转染的细胞培养上清液注射五龄期甜菜夜蛾幼虫,结果显示,接受缺失型病毒上清液注射的幼虫没有出现感染症状。其中大部分一直生长至化蛹,仅有少数几头幼虫意外死亡。接受缺失回复型病毒上清液注射的幼虫在7天后全部死亡、液化。这些结果暗示ac132缺失突变体ODV丧失了对甜菜夜蛾幼虫的感染性。