甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin，MBL)系C型凝集素超家族中胶凝素家族的成员，是机体天然免疫系统中的关键分子。MBL可选择性识别多种病原体表面以甘露糖或N-乙酰氨基葡萄糖等为末端糖基的糖结构，通过激活补体凝集素途径和调理吞噬作用清除病原体及受感染细胞。 血清MBL水平低下与许多感染性疾病及自身免疫病等有关，而这主要与MBL基因的6个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点有关，它们分别是启动子区-550(G/C)、-221(G/C)、+4(C/T)等3个位点(分别称为等位基因H/L、X/Y和P/Q)和结构基因第一外显子CGT52TGT、GGC54GAC、GGA57GAA等3个点突变(分别称为D、B、C，野生型为A)。 这6个SNP位点随机组合应该存在26(64)种单倍型，但由于结构基因SNP位点与不同的启动子单倍型连锁不平衡，至今只检测到7种常见的单倍型，分别是HYPA、LXPA、LYQA、LYPA、LYPB、HYPD及LYQC。不同的启动子基因型调控MBL基因转录水平，结合结构基因的不同突变体，使得不同种族人群间，甚至同一种族不同个体间的MBL血清水平相差很大。 我国是一个多民族人口大国，有必要对各民族人群MBL基因的多态性情况进行调查，以便为我国MBL缺损的防治研究提供决策依据。鉴于此，我们对佤族、白族、彝族及哈尼族人群MBL基因主要SNP位点进行了等位基因及其单倍型与基因型的研究。有关MBL基因SNP的研究对MBL的基础研究和临床实践都有重要意义，同时为医学的发展趋势——个体化治疗奠定基础。 第1章MBL基因7种常见单倍型标准质粒的构建 目的：构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。 材料与方法：1.以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板，采用SSP-PCR法扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段，将其克隆入T载体，获得相应的单倍型标准质粒。 2.以所获得的HYPA及LYQA单倍型标准质粒为模板，采用定点突变的方法，分别将该两质粒的MBL基因第一外显子52和57位密码相应的碱基突变，获得相应的突变体单倍型标准质粒。 结果：成功获得MBL基因单倍型HYPA、LXPA、LYQA、LYPA、LYPB、HYPD和LYQC标准质粒。 结论：构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒，为SSP-PCR及Real-timePCR检测MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。 第2章应用SSP-PCR技术研究佤族和白族人群MBL基因SNP及其单倍型与基因型 目的：对于MBL基因启动子区3个SNP位点及其单倍型与基因型已明确的佤族和白族普通人群样本，研究第一外显子第52、54及57位密码点突变并分析其MBL基因单倍型与基因型的分布情况。 材料与方法：1.采用SSP-PCR分析MBL基因第一外显子的52、54及57位密码点突变。 2.结合启动子区单倍型和基因型及SSP-PCR的检测结果，确定MBL基因主要SNP及其单倍型与基因型的频率，分析其在民族间分布的差异。 结果：1.所建立SSP-PCR反应体系实现了对MBL基因第一外显子3个点突变的检测，并可分析MBL基因单倍型及基因型。 2.确定了该2个民族MBL基因主要SNP位点等位基因及其单倍型与基因型的分布情况：中国白族和佤族人群MBL基因存在54位密码点突变，未发现52及57位密码点突变，单倍型以LYQA和HYPA为主，MBL基因型在白族中多见LYPA/LYQA、HYPA/HYPA、LXPA/LYQA、LYPB/LYQA和LYQA/LYQA，在佤族中则多见LXPA/LYQA、HYPA/LYQA、LYPA/LYQA、LYQA/LYQA及HYPA/HYPA。 结论：1.所建立的SSP-PCR技术特异性强，可适用于点突变和SNP的研究。 2.佤族和白族普通人群之间，MBL基因各等位基因及其单倍型与基因型存在差异。 第3章应用Real-timePCR-MB结合SSP-PCR研究彝族和哈尼族人群MBL 基因主要SNP及其单倍型与基因型 目的：1.建立特异性强、敏感性高、简单快捷的检测MBL基因主要SNP的技术，并适于分析其单倍型与基因型。 2.利用该技术对彝族和哈尼族人群MBL基因主要SNP位点进行研究，并明确其等位基因、单倍型及其基因型的分布情况。 材料与方法：1.收集彝族和哈尼族普通人群血样本，提取白细胞基因组DNA。 2.采用扩增包含等位基因X/Y的目的基因片段的SSP-PCR反应体系，检测MBL基因启动子区等位基因H/L和P/Q。建立Real-timePCR-MB荧光检测技术，分析2个人群MBL基因启动子区等位基因X/Y。 3.以MBL基因启动子区基因型为基础，采用SSP-PCR法扩增出含MBL基因第一外显子单倍型的片段，建立Real-timePCR-MB荧光检测技术分析2个人群MBL基因第一外显子第52、54及57位密码点突变。 4.结合SSP-PCR和PCR-MB的检测结果，确定2个人群MBL基因主要SNP、单倍型与基因型及其频率。 5.分析对比4个民族间MBL基因SNP及其单倍型与基因型分布的差异。 结果：1.对于启动子区，SSP-PCR反应体系实现了对等位基因H/L和P/Q的检测，Real-timePCR-MB检测技术分析MBL基因启动子区等位基因X/Y。建立SSP-PCR扩增包括MBL基因第一外显子单倍型片段的反应体系，Real-timePCR-MB检测技术分析MBL基因第一外显子第52、54及57位密码点突变。 2.在彝族人群中，MBL基因等位基因L和H频率相近，Y则高于X，P远高于Q；54位点突变的频率为0.082，未检测到52和57位密码点突变。MBL基因单倍型以HYPA、LXPA为主，基因型以HYPA/HYPA为最，次为LXPA/LXPA和HYPA/LYQA。在哈尼族人群中，等位基因L要高于H，Y高于X，P远高于Q；54位点突变的频率为0.119，未检测到52和57位密码点突变。MBL基因单倍型以HYPA、LYQA为主，基因型以HYPA/HYPA为最，其次为HYPA/LYQA和HYPA/LYPB。 3.分析了4个民族MBL基因主要SNP位点等位基因及其单倍型与基因型的分布情况： (1)等位基因L/H及P/Q在4个民族间的分布差异具有统计学意义(分别P＜0.0l，P＜0.01)，等位基因L在4个民族的总体分布均高于H，佤族和白族人群等位基因L频率高于其在彝族及哈尼族人群中的频率；4个民族中等位基因P均高于Q，而在彝族及哈尼族人群中等位基因P则远高于Q；X/Y等位基因在4个民族间的分布差异没有显著性意义，但等位基因Y要明显高于X。4个民族人群中均未发现第52、57位密码点突变，而54位密码点突变在这4个民族间存在显著性差异(P＜0.01)，以哈尼族为高。 (2)各单倍型在4个民族间的分布具有显著性差异(P＜0.01)：其中白族、佤族以LYQA和HYPA的频率较高，而彝族以HYPA、LXPA的频率较高，哈尼组以HYPA、LYQA较高，HYPA在彝族及哈尼族高达40％以上。 (3)各基因型在4个民族间分布的差异具有统计学意义(P＜0.01)：佤族以LYPA/LYQA、LYQA/LYQA、LXPA/LYQA、HYPA/LYQA及HYPA/HYPA频率较高；白族以LYPA/LYQA、LYQA/LYQA、LXPA/LYQA及HYPA/HYPA频率较高；而彝族以基因型HYPA/HYPA最高，占31.9％，次为LXPA/LXPA、HYPA/LYQA和HYPA/LYPA；哈尼族亦以基因型HYPA/HYPA最高，占24.8％，次为HYPA/LYQA及HYPA/LYPB。 结论：1.实时PCR-MB技术特异性强，简单快捷，能进行高通量、自动化的实时分析，完全适用于点突变和SNP的研究，技术特点明显优于传统的点突变或SNP检测方法。联用SSP-PCR和PCR-MB技术，有利于对功能基因的单倍型及基因型的研究。 2.佤族、白族、彝族及哈尼族人群间，MBL基因启动子区等位基因L/H、P/Q及第一外显子54位密码点突变的分布存在显著性差异，等位基因X/Y间未见显著性差异，4个民族中均未见52、57位密码点突变存在；4个民族间MBL基因单倍型和基因型的分布存在差异，单倍型HYPA和基因型HYPA/HYPA均有较高频率，在白族和佤族中基因型LYPA/LYQA和LYQA/LYQA的频率也较高，而在彝族及哈尼族中HYPA/LYQA亦较高。