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禽流感是一类由A型流感病毒引起的禽类的疾病。它给养禽业造成了巨大的经济损失,与此同时威胁着人类的健康。2013年3月,上海发现首例感染H7N9亚型流感的病例。2017年1月,广东发现的H7N9亚型流感病毒既能感染人也能感染禽类,且对禽类呈现高致病性。到2017年5月17日,人感染H7N9亚型流感病毒共1508例,其中死亡人数为577例,而且造成大量的禽类死亡。近年来,禽流感DNA疫苗等新型疫苗的研究越来越受关注。DNA疫苗具有安全性高和对变种病毒应对快速等优点,但仍存在转染效率和免疫原性低等不足,而开发筛选合适的佐剂可能会改善这些不足。为研制H7亚型禽流感DNA疫苗,首先通过RT-PCR扩增H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/O Y1/2013(H7N9)的HA基因,之后根据鸡密码子偏嗜性优化该基因,得到优化的HA基因op HA7。分别将H7亚型禽流感病毒的未优化和优化的HA基因克隆至真核表达载体p CK,构建了重组质粒p CKHA7和p CKop HA7。这些重组质粒经测序确认正确后,将其转染到293T细胞中,之后通过Western blot检测其表达量。结果显示重组质粒p CKop HA7和p CKHA7均能高效地表达目的蛋白HA,且优化型质粒表达水平明显高于未优化型质粒,表达的目的蛋白大小均约70 k Da。为研制鸡和鸭IFN-α、IL-2高效表达真核质粒,并将其作为DNA疫苗免疫佐剂,分别根据鸡和鸭密码子偏嗜性将NCBI(National Center for Biotechnology)序列数据库公布的鸡和鸭IFN-α、IL-2基因组序列进行优化,得到鸡和鸭IFN-α、IL-2优化基因(op Ch IFN-α、op Ch IL-2、op Du IFN-α、op Du IL-2)。通过PCR在优化的鸭IFN-α、IL-2基因3’端添加HIS标签序列,得到含有HIS标签的优化的鸭IFN-α、IL-2基因(op Du IFN-α+HIS、op Du IL-2+HIS)。之后分别将这些优化的基因(即op Ch IFN-α、op Ch IL-2、op Du IFN-α+HIS、op Du IL-2+HIS)克隆至真核表达载体p CK,构建了优化型重组质粒(p CKop Ch IFN-α、p CKop Ch IL-2、p CKop Du IFN-α+HIS、p CKop Du IL-2+HIS)。这些重组质粒经测序确认正确后,将其转染到293T细胞中,之后通过Western blot检测,结果显示这些优化型重组质粒均能高效地表达目的蛋白,且这些蛋白大小均在15-25 k Da之间。为评估免疫佐剂对DNA疫苗免疫效果的影响,试验将30只5周龄SPF鸡分为4组。其中对照组12只鸡注射p CK空载体,p CKop HA7免疫组6只鸡注射p CKop HA7质粒,p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α联合免疫组6只鸡注射p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α质粒,p CKop HA7和p CKop Ch IL-2联合免疫组6只鸡注射p CKop HA7和p CKop Ch IL-2质粒。采取腿部多点注射方式进行免疫。首免第14天进行二免,二免第14天用滴鼻点眼的方式以100μL 106 EID50的A/chicken/Guangdong/Q1/2016(H7N9)病毒攻击所有试验鸡。结果显示:p CK空载体对照组免疫期间血清抗体平均值都为0log2,攻毒后7天内全部死亡;p CKop HA7免疫组血清抗体平均值由一免第14天的0.6log2上升至二免第14天的4.8log2,攻毒后无死亡,排毒率为50%,保护率为50%;p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α联合免疫组血清抗体平均值由一免第14天的3.7log2上升至二免第14天的6.2log2,且高于p CKop HA7免疫组1.4log2,攻毒后无死亡,排毒率为33.33%,保护率为66.67%;p CKop HA7和p CKop Ch IL-2联合免疫组血清抗体平均水平由一免第14天的2.4log2上升至二免第14天的6.2log2,且高于p CKop HA7免疫组1.4log2,攻毒后无死亡,排毒率为33.33%,保护率为66.67%。综上所述,H7亚型禽流感DNA疫苗p CKop HA7免疫SPF鸡后能诱导机体产生良好的抗体水平,并抵御H7N9亚型禽流感病毒的攻击。此外,p CKop Ch IFN-α质粒和p CKop Ch IL-2质粒均能促进机体产生更高的抗体水平,增强了H7亚型禽流感DNA疫苗的免疫效果。