家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)抑制家蚕BmN细胞凋亡的功能研究

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由于特殊的进化地位、独特的侵染方式,以及对人和重要经济动物的致病性等,微孢子虫被科研人员广泛研究和关注。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是最先被命名的一种微孢子虫,它能够全身性感染家蚕,可造成养蚕行业的重大经济损失。近年有关家蚕微孢子虫的研究主要集中在与侵染相关的蛋白鉴定与功能分析等方面,而有关孢子在繁殖时期与宿主细胞的相互关系研究相对较少。家蚕微孢子虫作为微粒子病的主要病原,具有感染时间长、对子代危害程度大等特点,因此,本研究试图通过分析感染阶段孢子对宿主细胞在生化代谢方面的影响,为探明Nb与宿主细胞相互依存的分子机制提供科学依据,取得主要研究结果如下:  1、对接种Nb48h和96 h后的家蚕BmN细胞,与相应时期正常家蚕BmN细胞总蛋白,进行2D电泳分离。通过软件分析发现了56个蛋白的表达量在感染前后发生了显著改变(p<0.05)。通过质谱分析,成功鉴定了24个具有显著差异的蛋白(p<0.05),并预测了相关蛋白的理论分子量、等电点等性质。  2、对质谱鉴定得到的差异蛋白进行生物信息学分析,利用GO聚类分析法获取差异蛋白的生物学功能和意义,按照微孢子虫的寄生生活特性,重点关注了分子合成与运输、氧化压力与凋亡以及能量代谢三方面的生物学有关蛋白,并对这三类蛋白进行转录水平的分析。发现与分子合成和氧化压力相关的蛋白表达量显著上调(p<0.05),且GST酶活性在接种Nb后96 h显著上升;而参与泛素化降解系统有关的蛋白表达量显著降低(p<0.05)。  3、采用DNA Ladder、流式细胞术以及ROS检测方法证明了Nb感染BmN细胞后能够抑制宿主细胞凋亡的发生,并且在一定程度上能够阻止因ActD诱导的BmN细胞凋亡发生。  4、根据家蚕凋亡基因序列设计引物,经检测发现感染家蚕微孢子虫后,能够增强抗凋亡基因buffy的表达,抑制促凋亡基因apaf-1、cytc的表达;同时,western blot实验发现,家蚕微孢子虫能够抑制BmN细胞的细胞色素C表达。  综上所述,Nb一方面能够利用宿主BmN细胞的物质与能量来实现自身在宿主细胞内的繁殖过程;另一方面,为了能够更大程度地利用宿主细胞的生存环境,Nb能够促进宿主细胞抗氧化蛋白的表达来抑制活性氧的产生,同时,通过影响宿主细胞凋亡相关基因和蛋白来抵御宿主细胞的防御行为,为自身在宿主细胞内的长期发育和繁殖创造出更有利的生存条件。
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