背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经退行性疾病,给患者及家庭、社会带来沉重负担,然而目前尚无有效的治疗方法。脑内淀粉样蛋白β（Amyloid-β,Aβ）沉积是AD的主要病理标志。Aβ清除障碍被认为是散发型AD患者脑内Aβ积聚的主要原因。脑内Aβ的清除途径主要包括局部蛋白酶降解、小胶质细胞和星形胶质细胞吞噬作用等,或通过BBB转运、脑脊液重吸收、淋巴途径等转移至外周血液清除。我们及其他课题组研究发现,约有40%-60%的脑源性Aβ被转运到大脑以外的脏器组织清除,外周清除途径在清除脑内Aβ及AD的发生中发挥重要作用。然而,脑源性Aβ在外周清除的机制尚不清楚。阐明外周Aβ清除机制有助于进一步揭示AD的发病机制,从系统角度为AD干预提供新方向。肾脏是人体重要的代谢器官,参与排出各种代谢物并维持人体的体内平衡。近来,肾脏被认为是具有从血液中清除Aβ潜能的器官,但是目前没有任何肾脏是否具有生理Aβ清除功能的直接证据,其在AD发病机理中的病理生理作用仍然未知。在本研究中,我们旨在探讨生理情况下肾脏对Aβ的清除功能,并探讨肾脏的生理性Aβ清除功能在清除血液和大脑中Aβ的作用,及其对AD的治疗潜力。材料和方法1.肾脏生理性Aβ清除功能研究（1）肾脏存在Aβ沉积:取肾功能正常和无认知功能下降主诉人群的肾脏穿刺标本、9月龄的野生型（WT）小鼠和AD小鼠的肾脏标本。通过免疫组织化学和双重免疫荧光染色对2μm的人肾脏穿刺标本切片和5μm的小鼠肾脏切片进行染色。（2）肾脏具有生理性清除Aβ的功能:选择3月龄的雌兔,从肾动脉和肾静脉取血液,从膀胱取尿液。收集具有正常肾功能和认知功能的人的尿液。血液和尿液Aβ水平通过超灵敏的单分子阵列（SIMOA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。2.肾脏Aβ清除功能对脑内和血液中Aβ水平的影响我们将6月龄AD小鼠随机分为急性肾脏结扎组和假手术组（每组n=4）。在大脑右侧海马立体定位植入引导管并固定。经过恢复期后,将探针通过引导套管插入并连接到微透析泵。通过人工脑脊髓液（ACSF）每小时采集1管组织间液（ISF）等渗液,每2小时从尾静脉采集100μl血液。通过ELISA法检测ISF和血液中的Aβ水平。3.单侧肾脏切除对认知功能和AD相关病理的影响（1）肾脏移植供体认知功能和Aβ水平发生变化:我们共招募了17位接受手术3年以上的肾移植供体人群,以及年龄、性别匹配的无认知下降主诉的对照者（1:3）。进行临床评估和迷你精神状态检查（MMSE）,收集清晨空腹血液和尿液。通过SIMOA法检测血液和尿液中的Aβ水平,通过ELISA法检测血肌酐水平。（2）单侧肾切除加重AD认知功能障碍:我们将3月龄的AD小鼠随机分为单侧肾切除术组和假手术组（每组n=8）。对于手术组,分离、结扎并切除左肾,对于假手术组,仅开左侧腹腔后关闭。将小鼠饲养至9月龄,对单侧肾切除AD小鼠、假手术组AD小鼠以及年龄、性别匹配的野生型小鼠进行Y迷宫、旷场和莫里斯水迷宫等行为学测试。（3）单侧肾切除加重AD病理:取单侧肾切除术组和假手术组AD小鼠的脑、血液和肾脏样本。将大脑右半球固定、脱水、切片,并将左半球在液氮中速冻以备生化分析。通过免疫组织化学,双重免疫荧光染色和ELISA检测AD小鼠大脑的Aβ负荷、神经炎症、神经变性和tau磷酸化。使用免疫组织化学和双重免疫荧光方法对小鼠肾脏切片进行染色。4.增加肾脏Aβ清除对认知功能和AD相关病理的影响（1）呋塞米治疗可促进血液中Aβ的清除:对于急性实验,我们在第1天采集9月龄AD小鼠血液,在第2天腹腔注射呋塞米（50mg/kg）1小时后采集血液和尿液。对于慢性实验,将8月龄AD小鼠随机分为两组（每组n=8）,每4天腹腔注射速尿（40mg/kg）或磷酸盐缓冲液（PBS）,持续1个月并取血液。通过ELISA检测血液和尿液Aβ水平。（2）呋塞米治疗减轻认知障碍:对呋塞米处理1月的AD小鼠和对照组AD小鼠以及WT小鼠进行Y迷宫、旷场和Morris水迷宫实验。（3）呋塞米治疗减轻AD病理:对呋塞米处理1月的AD小鼠及对照组小鼠取脑、血液和肾脏样本。将大脑右半球迅速固定、脱水、切片,将左半球在液氮中速冻以备生化分析。通过免疫组织化学,双重免疫荧光染色和ELISA检测AD小鼠的Aβ负荷、神经炎症、神经变性和tau磷酸化等。结果1.肾脏生理性Aβ清除功能（1）Aβ在肾脏沉积:通过免疫组化染色和肾脏蛋白匀浆免疫印迹实验在人和AD小鼠的肾脏（尤其是肾小管）中检测到Aβ沉积。（2）肾脏生理性清除Aβ:肾静脉中的Aβ42和Aβ40水平分别比肾动脉低20%和11%,并且在兔尿中也检测到Aβ40和Aβ42。用SIMOA（而非ELISA）在人尿中检测到Aβ42的存在。以上结果提示肾脏具有清除Aβ的生理功能。2.肾脏Aβ清除功能对脑内和血液中Aβ水平的影响肾脏结扎后AD小鼠血液中Aβ40和Aβ42水平迅速升高,ISF中Aβ40和Aβ42水平也随着血液中Aβ水平的升高而升高。ISF中Aβ水平与血液中Aβ水平相关。提示肾脏的生理性Aβ清除功能在调节血液和脑内Aβ中起重要作用。3.单侧肾脏切除对认知功能和AD相关病理的影响（1）肾脏移植供体的Aβ水平变化:单侧肾切除的肾脏移植供体与正常对照组相比,血液Aβ水平较高,尿液Aβ水平较低。肾脏供体和对照组血液肌酐水平均正常且无明显差异。提示单肾切除可导致血液Aβ清除障碍,影响Aβ外周清除。（2）单侧肾切除加重认知障碍:新臂探索、旷场试验和Morris水迷宫试验一致显示,AD小鼠空间学习记忆能力较WT小鼠减退,单侧肾切除AD小鼠学习记忆能力进一步减退。（3）单侧肾切除加重AD病理:单侧肾切除AD小鼠血液Aβ水平高于对照组AD小鼠。单侧肾切除AD小鼠大脑中Aβ负荷加重,胶质细胞增生、神经炎症、神经变性和tau磷酸化等AD病理加重。4.增加肾脏Aβ清除对认知功能和AD相关病理的影响（1）短期呋塞米治疗可促进血液Aβ的清除:腹腔注射呋塞米可降低AD小鼠血液中Aβ40和Aβ42水平,提示呋塞米利尿治疗可加强肾脏的Aβ清除功能,有效促进血液Aβ的清除。（2）长期呋塞米治疗减轻认知功能障碍:呋塞米处理的AD小鼠在Morris水迷宫、旷场实验和Y迷宫实验中比PBS处理的AD小鼠表现更好,而年龄、性别匹配的WT小鼠表现最好。（3）长期呋塞米治疗减轻AD病理:长期呋塞米治疗后,AD小鼠大脑中Aβ负荷降低,胶质细胞增生、神经炎症、神经元凋亡和神经元丢失等AD病理减轻。结论在本研究中,我们在人和动物的肾脏和尿液中检测到存在Aβ,并且肾动脉血液中的Aβ水平高于肾静脉,证实肾脏具有清除Aβ的生理功能;急性单肾结扎实验表明肾脏的生理性Aβ清除功能在调节血液和脑内Aβ水平中起重要作用。单侧肾切除增加AD小鼠大脑Aβ沉积,加重认知功能障碍,表明肾脏的Aβ清除功能在清除脑内Aβ及AD的发生中发挥重要作用。呋塞米利尿治疗可促进血液Aβ清除,并可进一步减轻小鼠脑内Aβ负荷,改善认知功能障碍,具有AD防治潜能。综上,本研究揭示了肾脏的生理性Aβ清除功能,揭示了AD外周清除的新机制,并为通过系统途经清除脑内Aβ治疗AD提供了新方法。