斑马鱼miR-200家族(miR-200s)有六个成员:miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429a和miR-429b,分布在斑马鱼的6号和23号染色体上。我们之前的研究发现miR-200家族基因在斑马鱼胚胎发育过程中调控胚胎的体长,然而miR-200在成鱼中的功能还鲜有报道。本研究旨在探索miR-200家族在成鱼斑马鱼生殖发育中的功能。通过CRISPR/CAS9基因编辑技术,我们删除了斑马鱼基因组上miR-200家族的6个前体。6号染色体上miR-200家族成员(miR-141、miR-429b和miR-200c)敲除的突变体斑马鱼(下文简称6号miR-200敲除系,chr6-miR-200-KO)没有出现任何异于野生型(WT)斑马鱼的表型;23号染色体上miR-200家族成员(miR-200b、miR-200a和miR-429a)敲除的突变体(下文简称23号miR-200敲除系,chr23-miR-200-KO)雄鱼的精子运动能力显著高于WT斑马鱼,同时23号miR-200敲除系雌鱼不能正常繁殖。在雄鱼中,通过解剖观察WT和突变体的精巢形态和HE切片的组织学分析,发现两种突变体与WT相比并无任何异常;而后通过计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了斑马鱼的精子运动能力,分析结果显示6号miR-200敲除系突变体的精子运动能力与WT斑马鱼无显著性差异,然而23号miR-200敲除系突变体的精子运动能力显著高于WT斑马鱼和6号miR-200敲除系突变体。通过targetscan软件在线预测与精子生成及精子运动能力相关的miR-200的靶基因,我们筛选出了amh、wt1a和srd5a2b三个候选靶基因,并且在WT和23号miR-200敲除系突变体中的定量PCR结果也证实它们与miR-200的靶向关系。体外荧光素酶报告系统的结果显示,miR-200a、miR-200b、miR-429a能够靶向结合amh、wt1a和srd5a2b的3’UTR。在体内,通过在成鱼中注射miR-200a、miR-200b、miR-429a稳定的模拟物以达到模拟过表达miR-200a、miR-200b、miR-429a的目的,结果显示过表达miR-200a、miR-200b、miR-429a的雄鱼的精子运动能力显著下降,同时精巢中amh、wt1a和srd5a2b的表达也显著下调。之前的实验结果证实p53是miR-200的直接上游,而后我们检测了p53突变体中的miR-200a、miR-200b和miR-429a的表达,发现突变体中这三者的表达量异常低于WT;通过CASA检测发现,p53突变体的雄鱼精子运动能力显著高于WT。WT斑马鱼雄鱼的梯度雌二醇浸泡实验结果显示,梯度的雌二醇可以诱导miR-429a梯度上调表达和精子运动能力的下降,同时p53的表达显著上升,然而对p53突变体进行同样的雌二醇浸泡操作发现p53突变体的精子运动能力并没有受到雌二醇的影响。于是,我们得出以下结论:雌二醇可通过激活p53途径直接作用于miR-200a、miR-200b和miR-429a,影响下游靶基因amh、wt1a和srda2b的表达,导致最终的精子运动能力受影响。在雌鱼中,我们发现23号miR-200敲除系突变体不能正常繁殖,而6号miR-200敲除系突变体的生殖能力与WT斑马鱼无异。通过对性成熟的斑马鱼雌鱼进行解剖及切片的比较观察,发现6号miR-200敲除系和23号miR-200敲除系突变体与WT的卵巢没有差异,并且23号miR-200敲除系突变体和WT一样,里面各个时期的卵母细胞都存在,并无差异。而后,通过更细致的观察,我们发现23号miR-200敲除系突变体雌鱼和WT的卵细胞均可正常发育到VI期,并且均可在体外诱导达到最终的卵母细胞成熟阶段。通过h CG的催产挽救,23号miR-200敲除系突变体可以被部分挽救,并且催产后突变体中的卵细胞均透明达到排卵前的阶段,但大部分突变体的成熟卵细胞不能从滤泡细胞中脱落进入卵巢腔,不能人工挤出自由的卵细胞。促性腺激素的主要成分为LH和FSH,在斑马鱼中,fshb突变体雌鱼没有出现任何生殖障碍,所以我们锁定LH在整个排卵过程中发挥着非常重要的作用。通过q PCR的检测,发现在突变体中lhb的表达明显低于WT,同时我们检测了在23号染色体上的miR-200s的靶基因wt1a的表达,并且验证了lhb的启动子活性可以有效的被Wt1a蛋白抑制。于是我们得出结论23号染色体上的miR-200通过调控下游靶基因wt1a的转录来调控lhb的表达。那LH又是如何影响斑马鱼的成熟及排卵的呢?我们猜测这一系列的排卵缺陷是由LH的下降引起下游的孕激素及前列腺素在排卵过程中的不足导致的。于是我们验证这两个激素在排卵中的作用。在WT斑马鱼排卵前,DHP在早上5点半左右达到最高水平,通过注射DHP发现和h CG挽救结果一致,23号miR-200敲除系突变体雌鱼可以被部分挽救,这也就证实了我们的一个猜想,突变体的生殖障碍有一部分原因是由于LH下调导致排卵前孕酮供应不足导致不能正常成熟及排卵。另一方面,通过检测发现ptgs2a在排卵前显著上升,然而前列腺素PGE2和PGF2并不能挽救23号miR-200敲除系突变体雌鱼。与此同时,我们构建了斑马鱼ptgs2a敲除的突变体来确定前列腺素在生殖过程中的作用,结果发现ptgs2a突变体雌鱼是可育的,并没有出现任何排卵障碍。于是我们认为前列腺素没有参与miR-200调控LH诱导卵细胞成熟及排卵的这个过程。总结23号染色体上的miR-200成员在雌鱼中的作用,我们得出以下结论:斑马鱼23号染色体上的miR-200成员miR-200a、miR-200b和miR-429a可以通过靶向结合转录抑制因子wt1a来调控lhb的表达,而下调了的LH不能诱导产生足够的DHP导致成熟及排卵的失败。综上所述,我们认为位于23号染色体上的miR-200家族成员在斑马鱼成鱼的生殖系统中发挥着重要作用,分别影响了雄鱼的精子运动能力和雌鱼的成熟及排卵。