背景心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的发生发展与天然免疫应答过度激活密切相关。Toll样受体(toll like receptors,TLRs)介导的信号通路在天然免疫应答及炎症反应中发挥着重要的作用。ECSIT(evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathways)是 TLRs/IL-1R 介导的信号通路中高度保守的信号分子,参与调节MEKK1和NF-κB等信号通路。近期有研究发现,TLR1/2/4介导的细胞内信号可以通过影响ECSIT蛋白与线粒体复合物的相互作用,诱导巨噬细胞线粒体产生活性氧,从而导致线粒体功能紊乱。线粒体结构损伤及功能障碍是导致心肌I/R损伤的的重要病理机制。但是,心肌I/R损伤后TLRs介导的免疫炎症应答与线粒体功能的内在关联以及调控的关键节点分子,尚不清楚。本研究探讨了 ECSIT是否可能作为调控免疫炎症信号与线粒体功能内在关联的关键节点分子在心肌I/R损伤的发生发展中发挥重要作用,并着重研究了其机制是否与ECSIT线粒体定位的变化相关。目的阐释ECSIT蛋白对心肌I/R损伤的调控作用及机制,着重明确ECSIT蛋白的线粒体定位及其对线粒体功能的影响是否在心肌I/R损伤中发挥重要作用,为临床防治心肌I/R损伤及心力衰竭提供新的线索。方法1.动物在体实验通过结扎小鼠冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)45min再灌注24 h的方法复制小鼠心肌I/R损伤模型。为了解ECSIT蛋白与心肌I/R损伤的相关性,采用C57/BL6雄性小鼠随机分为假手术组(Sham)和心肌I/R损伤组(I/R),观察心肌I/R损伤后总蛋白及线粒体蛋白中ECSIT蛋白表达的变化以及其与线粒体组装蛋白NDUFAFI的相互作用。为明确ECSIT蛋白线粒体定位在心肌I/R损伤的作用,C57/BL6雄性小鼠在结扎LAD前一周采用心肌局部转染腺病毒包装的全长ECSIT(含有影响其在线粒体定位所必需的N端48个氨基酸)使其主要在线粒体过表达,实验分为四组,分别是:假手术组(Sham)、心肌I/R组(I/R)、心肌I/R+GFP腺病毒对照组(I/R+AdvGFP)和心肌I/R+过表达ECSIT腺病毒组(I/R+AdvECSIT),观察心肌局部过表达ECSIT(主要是ECSIT的线粒体定位表达增加)对心肌I/R损伤后心肌细胞损伤、凋亡和心脏功能的影响,并探讨其调控机制。为验证ECSIT蛋白线粒体定位是否的确在心肌I/R损伤中发挥重要作用,进一步采用转基因技术构建线粒体靶向性过表达ECSIT的转基因小鼠,开展相关研究。采用雄性ECSIT线粒体靶向过表达转基因小鼠与野生型C57/BL6小鼠,随机分为4组,分别是:野生型小鼠假手术组(WT Sham)、野生型小鼠心肌I/R组(WT I/R)、线粒体靶向性过表达ECSIT转基因小鼠假手术组(TG Sham)和线粒体靶向性过表达ECSIT转基因小鼠心肌I/R组(TGI/R),观察线粒体靶向过表达ECSIT对心肌I/R损伤后心肌梗死面积及心脏功能的影响。2.体外细胞实验心肌细胞线粒体损伤和心肌细胞凋亡是心肌I/R损伤的主要病理变化。采用1-3天SD乳大鼠培养原代心肌细胞以及大鼠成肌细胞系H9C2,以无糖培养基加缺氧1小时后给予常规培养基加常氧4小时,建立心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型。为观察ECSIT蛋白表达及其线粒体定位与心肌细胞H/R损伤的相关性,原代乳大鼠心肌细胞随机分为对照组(Control)和H/R组(Hl/R4),观察心肌细胞H/R损伤后总蛋白及线粒体蛋白中ECSIT蛋白表达的变化以及其与线粒体组装蛋白NDUFAF1的相互作用。为明确ECSIT蛋白线粒体定位在心肌细胞H/R损伤的作用,分别通过转染腺病毒包装的全长ECSIT(AdvECSIT)和ECSIT缺失体(Adv△ECSIT)(缺失线粒体定位所必需的N端48个氨基酸)。体外培养心肌细胞于H/R前48小时分别转染AdvECSIT和 Adv△ECSIT。实验分组为:对照组(Control)、H/R 组(H1/R4)、H/R+GFP 腺病毒对照组(H1/R4+AdvGFP)、H/R+过表达 AdvECSIT 组(H1/R4+AdvECSIT)和 H/R+过表达Adv△ECSIT组(H1/R4+Adv△ECSIT),探讨ECSIT的线粒体定位表达对心肌细胞H/R损伤后心肌细胞线粒体结构、功能和细胞凋亡、坏死的影响及其机制。3.观测指标采用Evans Blue-TTC染色评价心肌梗死面积,通过超声心动图检测心脏功能;采用电子透射显微镜检测心肌线粒体结构;通过蛋白质免疫共沉淀检测ECSIT与TRAF6、NDUFAF1的相互作用以及ECSIT的泛素化修饰,探索心肌I/R损伤的分子机制;通过Western blot检测Cleaved-Caspase3水平评价凋亡信号通路激活情况。采用MTT和PI、Hoechrst双染检测细胞损伤情况;通过DHE染色和Mito Sox染色检测心肌细胞活性氧产生情况;采用电子透射显微镜检测心肌细胞线粒体结构;通过细胞免疫荧光实验检测外源性ECSIT定位情况;通过线粒体耗氧量测定心肌细胞线粒体功能;采用Caspase3/7酶活性检测试剂盒检测心肌细胞凋亡情况;通过Westerm blot检测Caspase9,Cleaved-Caspase3水平评价凋亡信号通路激活情况。结果一、ECSIT蛋白及其线粒体定位在心肌I/R损伤中的作用及其机制(一)心肌I/R损伤后ECSIT蛋白线粒体定位表达的变化及其影响线粒体功能的机制1.结扎冠状动脉左前降支45min,再灌注24h后,Evans Blue-TTC染色显示I/R损伤后梗死区面积/危险区面积(ischemia area/risk area,IA/RA)达到48.6±3.25%;透射电子显微镜观察发现心肌I/R损伤后心肌线粒体出现明显空泡化,腊结构消失和线粒体边界不清的超微结构变化;超声心动图检测显示I/R损伤后射血分数(ejection fraction,EF%)与缩短分数(fractional shortening,FS%)分别下降了下降36.94%和43.12%。提示心肌I/R损伤后,缺血区心肌组织出现明显梗死和线粒体超微结构损伤,同时伴有心功能减退。2.与假手术组相比,心肌I/R损伤后,心肌组织内总蛋白中ECSIT的表达并没有发生明显改变,而心肌组织线粒体蛋白中ECSIT蛋白表达则明显下降。蛋白酶K(proteinase K)敏感性实验发现,线粒体内ECSIT蛋白表达的减少主要是定位于线粒体内膜的ECSIT蛋白明显减少。此外,与假手术组相比,心肌I/R损伤可以使TRAF6募集到线粒体外膜,线粒体蛋白中TRAF6与ECSIT结合明显增加,同时ECSIT蛋白泛素化增加,并且还发现心肌组织线粒体内ECSIT与线粒体组装蛋白NDUFAF1的结合明显下降。提示ECSIT蛋白在线粒体上的表达与心肌I/R损伤密切相关,ECSIT参与心肌I/R损伤机制可能和ECSIT与TRAF6和NDUFAF1的相互作用有关。(二)心肌局部转染增加心肌ECSIT线粒体定位表达可减轻心肌I/R损伤1.心肌局部注射转染AdvECSIT增加心肌组织内ECSIT线粒体定位表达,Evans Blue-TTC染色显示,与I/R组相比,转染AdvECSIT后IA/RA下降38.9%(49.26±2.97%vs.30.52±1.31%)。超声心动图检测显示,与 I/R 组相比,心肌局部转染AdvECSIT后EF%与FS%分别上升了 21.8%(43.49±2.29%vs.52.98±2.14%)和 39.0%(19.95±1.56%vs.27.73±0.94%)。并且增加心肌线粒体内ECSIT表达可抑制由于I/R损伤所诱导的心功能下降和细胞凋亡信号途径的激活。揭示线粒体定位的ECSIT参与调节心肌I/R损伤的发生发展。2.增加心肌组织内ECSIT线粒体定位表达后可增加线粒体内ECSIT与NDUFAF1的结合,提示ECSIT的线粒体定位表达可通过调节其与NDUFAFI的结合参与心肌I/R损伤发生发展的调控。(三)线粒体靶向性过表达ECSIT对心肌I/R损伤的影响为进一步证实ECSIT线粒体定位对I/R损伤的作用,构建了线粒体靶向性过表达ECSIT的载体质粒,通过细胞免疫荧光实验检测其表达载体质粒可以完全定位在线粒体上;并使用该质粒构建了线粒体靶向过表达ECSIT的转基因小鼠,通过TTC染色显示,与野生型小鼠心肌缺血-再灌注组相比,心肌线粒体靶向性过表达 ECSIT 后,IA/RA 减少 40.5%(49.87±2.17%vs.29.67±1.73%);超声心动图检测显示,与WT I/R组相比,线粒体靶向过表达ECSIT 转基因小鼠 I/R 后,EF%与 FS%分别上升了 23.9%(39.63±2.49%vs.49.09±1.77%)和 29.7%(18.54±1.45%vs.24.04±1.05%)。提示增加线粒体内ECSIT定位后可改善由于I/R损伤所诱导的心功能下降和梗死面积的增加。二、ECSIT线粒体定位对心肌细胞H/R损伤的影响及其分子调控机制(一)心肌细胞H/R损伤后ECSIT蛋白线粒体定位表达的变化1.原代乳大鼠心肌细胞H/R损伤后,可出现心肌细胞线粒体结构的改变和活性氧产生增加。提示心肌细胞H/R可以导致明显的细胞损伤,并且心肌细胞H/R损伤可导致线粒体失衡。2.与对照组相比,心肌细胞缺氧1小时复氧1小时(H1/R1),无论是总蛋白还是线粒体蛋白内ECSIT表达均未发生明显变化;在缺氧1小时复氧4小时后,ECSIT总蛋白含量仍未改变,但线粒体内ECSIT表达明显下降,并且导致ECSIT与NDUFAF1的结合下降。提示H/R损伤与ECSIT蛋白在线粒体定位表达减少密切相关。(二)ECSIT蛋白线粒体定位表达变化对心肌细胞H/R损伤的影响1.构建全长ECSIT腺病毒(AdvECSIT)和 ECSIT缺失体腺病毒(Adv△ECSIT)(缺失N端48个氨基酸线粒体定位的功能区域),Westerm blot和心肌细胞免疫荧光实验显示AdvECSIT转染体外培养原代乳大鼠心肌细胞可明显增加心肌细胞ECSIT线粒体定位表达,而过表达Adv△ECSIT几乎无ECSIT蛋白的线粒体定位表达。2.采用透射电子显微镜和线粒体耗氧量检测显示,转染AdvECSIT增加线粒体ECSIT蛋白定位表达可改善H/R诱导的线粒体形态结构损伤和功能紊乱;Western blot和Caspase3酶活性检测,显示增加线粒体ECSIT定位表达可抑制H/R导致的心肌细胞凋亡。而转染Adv△ECSIT不能发挥类似过表达全长ECSIT的作用,提示ECSIT发挥保护心肌H/R损伤的作用与其线粒体定位表达密切相关。(三)ECSIT蛋白线粒体定位表达变化调控心肌细胞H/R损伤的分子机制增加ECSIT线粒体定位可以改善由于H/R损伤引起的与NDUFAF1结合减少,进而改善H/R损伤后线粒体复合物I的活性下降,改善线粒体功能与线粒体形态结构紊乱,减少细胞总的ROS和线粒体ROS的产生,抑制细胞凋亡与坏死。揭示ECSIT发挥保护心肌细胞H/R损伤的作用依赖其自身线粒体定位以及与NDUFAF1相互作用。结论综合整体动物实验与体外细胞实验,提示ECSIT蛋白及其线粒体定位在心肌I/R损伤的发生发展中发挥着重要的作用。其机制可能与ECSIT定位线粒体后与线粒体呼吸链复合物I组装蛋白NDUFAFI的相互作用,调节线粒体活性氧的产生及线粒体功能从而调节心肌细胞死亡,最终改善心肌I/R损伤后心脏功能减退。上述研究结果不仅有助于阐明心肌I/R损伤的分子机制,而且可为临床防治心肌I/R损伤提供有效的生物学靶点和新思路。