苜蓿（Medicago Sativa L.）是世界上分布最广泛的一种豆科多年生牧草，素有“牧草之王”的美誉。随着分子生物学的发展，传统农业正在向分子农业转变。植物生物反应器作为一种大规模重组蛋白的生产系统，已广泛运用于工业、农业尤其是生命科学以及医学制造领域。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，苜蓿作为一种生物反应器,为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系。它具有操作方便、便于大面积推广等许多潜在的优势。利用转基因苜蓿作为植物生物反应器生产工业酶制剂、疫苗、药用蛋白等的操作路线与现在的苜蓿转基因技术路线相同，即目的基因的克隆→载体构建→苜蓿外植体的转化→转基因植株再生；只需在得到转基因植株以后，再从转基因植株中进行疫苗、酶制剂、药用蛋白等的下一步提取工作。论文针对外源蛋白在转基因苜蓿植物组织中表达量低、转基因苜蓿的种质保存困难的问题进行研究。本论文选用农杆菌株系GV3101，含gus/npt II的双相载体pCAMBIA2301和pBin9，以N4.4.2作为转化受体进行转化,在卡那霉素筛选压下，经过一系列的诱导培养，形成转基因植株。然后，通过GUS组织化学定位分析转基因植株中的GUS表达，并进一步通过PCR分子检测。经分析检测确定为阳性植株后，对转基因植株进行体细胞胚诱导，通过GUS荧光定量分析不同组织中的GUS表达，评价外源GUS在苜蓿体细胞胚中的积累。同时，对获得的7个转基因苜蓿株系进行体细胞胚的诱导，随后利用外源ABA和6种干燥剂处理来获得转基因苜蓿人工种子，考察不同株系转基因苜蓿人工种子的萌发率和遗传特性。以上研究为苜蓿体细胞胚作为植物反应器生产外源有用蛋白和转基因人工种质保存提供理论依据。主要结论如下：1.进一步完善了苜蓿转化体系。以N4.4.2为转化受体，感染的子叶期苜蓿体细胞胚在75mg/L卡那霉素筛选压下，经过一系列诱导培养，最终获得转基因植株。然后，通过GUS组织化学定位分析检测转基因植株不同组织器官中的GUS表达，并进一步通过PCR和Southern杂交确定转基因的整合和转化率。结果证实：苜蓿次级体细胞胚的遗传转化法相对于叶柄、叶子和上胚轴等为外植体的常规的转化方法，缩短了苜蓿转化的时间；次级体细胞胚作为外植体的遗传转化方法大大提高了次级体细胞胚的诱导频率；它还提供了一个导入多基因到苜蓿植株中的方法。同时，这种方法也适用于别的转化效率低的一些苜蓿品种，拓宽了苜蓿遗传转化方法。2.证明了苜蓿体细胞胚是最佳的外源蛋白表达材料，为苜蓿体细胞胚作为生物反应器生产外源蛋白提供理论依据。以N4.4.2紫花苜蓿品种叶柄为材料，进行农杆菌GV3101介导的苜蓿遗传转化。农杆菌株系GV3101包括双向载体pBin9。这个载体含有2个CaMV35s启动子调控下的gus/npt II融合基因。感染的叶柄外植体置于不同的转化培养基中培养，形成了适合于农杆菌介导的转基因体系。获得的转基因植株，采用组织化学定位分析GUS表达，进一步的PCR方法检测其中11个抗性株系，并对表现为阳性的转基因植株的不同组织器官进行GUS荧光定量分析。结果表明：GUS外源蛋白表达量在体细胞胚中明显高于根、茎和叶，是根、茎和叶的3~6倍；而在根、茎和叶中GUS表达量相似，没有明显的差异。3.本试验建立了使用干燥的转基因苜蓿体细胞胚作为种质保藏的模式体系。将转基因苜蓿植株进行体细胞胚的诱导，随后,子叶期的体细胞胚在含有10mM ABA的BOi2Y培养基中培养14d，随后，体细胞胚依次放在相对湿度恒定的饱和溶液中：硫酸钾饱和溶液（87%）、碳酸钠饱和溶液（87%）、氯化钠饱和溶液（75%）、硝酸铵饱和溶液（63%）、四水硝酸钙饱和溶液（50%）、二水碳酸钾饱和溶液（43%）6种干燥剂中缓慢干燥，获得干化的转基因体细胞胚。干化的体细胞在MSO培养基中萌发，获得转基因苜蓿植株。结果表明：干化的体细胞胚和未干化的体细胞胚具有相似的萌发率，恢复的植株在形态上相似。经过Southern杂交分析遗传变异特性，源自干化的和未干燥的苜蓿体细胞胚恢复的植株具有相同的整合位点，研究证实了干燥的体细胞胚可以用于转基因苜蓿种质保藏的可行性。4.35s CaMV是一种强启动子，通常用于转基因的组成型表达调控。在苜蓿转化试验中还发现，使用2个35s CaMV启动子调控GUS表达时，明显高于单个35s CaMV启动子调控的GUS表达。为了获得高水平的外源蛋白表达，可以使用双强35s CaMV启动子的载体。