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目的:本论文选用课题组前期筛选出的人口腔上皮癌KB细胞及耐药株KB/ADM,采用斑马鱼异位移植瘤模型,研究氯化两面针碱(NC)对KB/ADM细胞的耐药逆转作用及NC对Topo m RNA和蛋白表达的影响,探讨NC逆转耐药的作用机制。方法:(1)斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:使用红色荧光染料(CM-Dil)标记人口腔上皮癌细胞,以显微注射的方式移植到受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约800个细胞,建立斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型;将注射了人口腔上皮癌细胞的斑马鱼放置35℃培养至3dpf,在显微镜下挑选出移植肿瘤一致性较好的斑马鱼,在注射肿瘤细胞后的0天、1天、2天和3天分别观察、拍照并保存图片,观察人口上皮癌细胞是否能在斑马鱼体内存活并增殖。(2)NC对人口上皮癌耐药性的逆转作用研究:(1)确定NC的最大耐受浓度(MTC)、依托泊苷(VP-16)MTC和NC联用VP-16的浓度:随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼180尾于六孔板中,分别水溶给予NC0.1μM、1μM、5μM、10μM和50μM浓度;VP-16C/1000、C/500、C/100、C/50和C/10浓度(C为原液浓度);NC联用VP-16时,NC选择其MTC进行检测,VP-16选择MTC、1/2 MTC和1/4MTC进行检测;每孔(浓度组)斑马鱼尾数为30尾,每孔容量为3 m L,同时设置正常对照组。药物处理期间,每天对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼;2天后,观察记录斑马鱼的表型和死亡情况,确定NC和VP-16对斑马鱼的MTC及NC联用VP-16时的浓度。(2)斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:参见“方法(1)”。(3)分组及给药:按“方法(1)”操作,在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予单用VP-16C/100浓度、单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度、NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100,阳性对照组为维拉帕米(VRP)联用VP-16,同时设置模型对照组,每实验组均处理30尾模型斑马鱼,给药2d后,用荧光显微镜拍照获取移植瘤的荧光图片,分析各实验组斑马鱼移植瘤荧光强度,评价NC对斑马鱼KB/ADM移植瘤的多药耐药逆转作用。计算肿瘤多药耐药逆转作用。(3)NC对肿瘤组织中Topo I、TopoⅡα、TopoⅡβm RNA及蛋白表达的影响:(1)Real time PCR检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表达的影响;(2)Western blot检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白表达的影响。结果:(1)在注射肿瘤细胞0天、1天、2天、3天斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤荧光强度总和(mean±SE)分别为(0.59±0.03)×10~5、(1.82±0.08)×10~5、(2.07±0.12)×10~5、(1.21±0.06)×10~5像素。(2)(1)NC对斑马鱼的MTC为10μM、VP-16对斑马鱼的MTC为C/100、NC联用VP-16的MTC为NC10μM+VP-16C/100。?模型对照组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.85×10~5像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.79×10~5像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为14.63%。模型对照组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.75×10~5像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.66×10~5像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为1.87%。单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为3.94×10~5、3.34×10~5、2.79×10~5像素,肿瘤抑制率分别为17.06%、29.60%、41.25%,与模型对照组比较,单用NC1.1μM浓度组p>0.05,单用NC3.3μM、10μM浓度组存在统计学差异(p<0.01&p<0.001)。NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为2.80×10~5、2.42×10~5、2.13×10~5像素,肿瘤抑制率分别为41.12%、48.99%、55.19%,与模型对照组比较,具有显著差异(p<0.001,p<0.001,p<0.001)。阳性对照VRP联用VP-16组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为2.46×10~5像素,与模型对照组相比,具有显著性差异(p<0.001),肿瘤抑制率为48.30%。NC1.1μM+VP-16C/100、NC3.3μM+VP-16C/100、NC10μM+VP-16C/100、VRP联用VP-16组的肿瘤多药耐药逆转率分别为40.00%、48.01%、54.33%、47.31%,与模型对照组相比,具有显著性差异(p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001)。(3)?Topo I m RNA相对表达结果,敏感组中Topo I m RNA表达水平上调,无统计学意义,在耐药组中表达水平均上调(P<0.05,P<0.05,P<0.05);TopoⅡαm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡαm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组中依次呈下调趋势(P<0.01,P<0.01,P<0.01);TopoⅡβm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡβm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组表达水平均下调(P<0.05,P<0.05,P<0.05);?Topo I蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平上调(P<0.01),在耐药组中表达水平均上调(P<0.05,P<0.01,P<0.01);TopoⅡα蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调(P<0.01),在耐药组中依次呈下调趋势(P<0.01,P<0.01,P<0.01);TopoⅡβ蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调(P<0.05),在耐药组中表达水平均下调(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。结论:(1)人口腔上皮癌细胞能够在斑马鱼体内存活并繁殖,说明造模成功,可进行后续实验。(2)NC在体内能够明显抑制人口腔上皮癌移植瘤的生长,同时可逆转KB/ADM细胞MDR的作用。(3)NC逆转KB/ADM细胞MDR作用的机制可能是通过抑制TopoⅡα、TopoⅡβ实现,对Topo I的作用有待研究。