论文部分内容阅读
目的:由于胰腺癌恶性程度高,而且其解剖位置较深,早期症状不明显,并且没有敏感的肿瘤标志物,因此胰腺癌的早期诊断和治疗非常困难。miRNA是长度在17～25个核苷酸的内源性非编码小RNA,在组织器官及肿瘤中特异性很高,这一群体通常具有抑癌基因与癌基因的双重作用。诸多研究显示miRNA在恶性肿瘤的发生、发展中起着举足轻重的作用。本研究主要通过qRT-PCR检测hsa-miR-590-3p(以下简称miR-590-3p)在胰腺癌中的表达;通过细胞功能学实验探讨miR-590-3p对胰腺癌恶性生物学行为的影响;借助生物信息学分析与实验验证相结合的方法,探索miR-590-3p直接作用的靶基因及作用通路,为研究胰腺癌的诊断治疗提供新的治疗思路和作用靶点。研究方法:1、通过qRT-PCR实验检测胰腺癌组织及其配对的正常胰腺组织的表达量,在组织水平揭示miR-590-3p在胰腺癌中的表达及临床病理学意义。通过qRT-PCR实验检测转染miR-590-3p模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitors)在胰腺癌细胞系中的转染效率。转染miR-590-3p模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitors)后,通过MTT和克隆形成实验检测PANC-1细胞和Capan-2细胞的增殖能力变化;使用流式细胞术对Capan-2细胞和PANC-1细胞的细胞周期变化进行检测;通过Transwell实验检测PANC-1和Capan-2细胞的迁移和侵袭能力变化。2、利用生物信息学技术(TargetScan)预测miR-590-3p可能直接作用的靶基因。通过免疫组化揭示PPP2R2A及p27与miR-590-3p在胰腺癌表达中的临床病理学意义及其相关关系。使用Western blot检测miR-590-3p模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitors)转染后PANC-1和Capan-2的PPP2R2A、p27及G1/S细胞周期通路相关蛋白CDK2,cyclinE2,p21表达变化。利用生物信息学技术预测miR-590-3p与PPP2R2A、p27mRNA的3’UTR区的结合区域。构建PPP2R2A、p27mRNA的3’UTR区野生型及突变型双荧光报告基因质粒,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-590-3p与PPP2R2A、p27的直接结合情况。构建PPP2R2A、p27过表达质粒,与miR-590-3p mimics共转染后,使用MTT,集落形成和transwell实验测定细胞增殖和迁移侵袭能力的变化。结果:1、通过qRT-PCR实验检测胰腺癌组织及其配对的正常胰腺组织的表达量,发现胰腺癌组织中miR-590-3p的表达量相对高于配对正常胰腺;通过miR-590-3p表达与胰腺癌临床病理学分析结果可知,miR-590-3p的高表达与肿瘤大小(P=0.042)及术前CA19-9水平(P=0.046,R=0.283)显著相关,但与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度、UICC分期、淋巴结转移及术后肝转移均无明显相关性。6个胰腺癌细胞系中Capan-2细胞miR-590-3p相对高表达,PANC-1细胞miR-590-3p相对低表达。因此我们选取Capan-2细胞和PANC-1细胞来完善后续实验。Capan-2细胞和PANC-1细胞瞬时转染miR-590-3p模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitors)用于细胞功能学实验。MTT实验和集落形成实验显示MiR-590-3p高表达可促进细胞增殖;transwell实验结果显示MiR-590-3p高表达可提高细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术实验提示MiR-590-3p高表达细胞G0/G1期缩短,S和G2/M期延长。降低miR-590-3p的表达水平则会造成细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力降低,使细胞周期分布呈现与miR-590-3p表达升高时相反的结果。2、Western blot实验揭示了miR-590-3p的过表达下调了胰腺癌细胞中PPP2R2A、p27及G1/S细胞周期通路相关蛋白p21的表达,同时上调CDK2,cyclinE2的蛋白表达。反之抑制miR-590-3p的表达上调了胰腺癌细胞中PPP2R2A、p27及G1/S细胞周期通路相关蛋白p21的表达,同时下调CDK2,cyclinE2的蛋白表达。免疫组织化学实验结果揭示了miR-590-3p与临床肿瘤样本中的p27和PPP2R2A表达呈负相关关系。双荧光素酶报告基因实验验证了miR-590-3p可以与p27和PPP2R2A的3’UTR区直接结合。P27和PPP2R2A过表达逆转了miR-590-3p对细胞增殖和迁移侵袭的促进作用。结论:1、MiR-590-3p促进胰腺癌的细胞增殖,迁移和侵袭作用。2、MiR-590-3p直接作用于p27和PPP2R2A并抑制G1/S细胞周期通路促进胰腺癌发生发展的进程。