论文部分内容阅读
L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,在自然界中可游离存在,而自然界中不存在游离的D-丙氨酸。D-丙氨酸广泛存在于细菌细胞壁的肽聚糖中,以D-丙氨酰-D-丙氨酸的形式参与肽聚糖层的合成。丙氨酸消旋酶具有催化L-丙氨酸和D-丙氨酸相互转化的作用,属于5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型,归类于异构酶家族。该酶通过消旋反应为细菌细胞壁的合成提供必要的D-丙氨酸,是原核生物必不可少的一类酶蛋白。此外,丙氨酸消旋酶对抑制芽胞杆菌的孢子萌发具有关键作用。丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关。因此基于丙氨酸消旋酶的分子机制寻找酶的抑制剂,已成为抗生素药物研制的靶标而被广泛研究。本研究从专性嗜碱芽胞杆菌(Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4)中克隆获得一个长约1100bp的丙氨酸消旋酶基因(dadXOF4)的开放阅读框,该基因通过营养缺陷性实验证明了其具有丙氨酸消旋酶的催化活性。经过基因的克隆、重组质粒的构建、目的蛋白的原核表达及亲和层析纯化、分子筛层析获得了单一的酶蛋白溶液。通过对酶学特性的研究,测得该蛋白分子量约为41kDa,最适pH值为10.5,最适反应温度为40℃,且底物特异性专一,在最适条件下对底物L-丙氨酸的亲和常数Km为41.79mM,Vmax为10500units/mg,对底物D-丙氨酸的Km为14.79 mM,Vmax为3708 units/mg。将其与来自腾冲嗜热杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶进行氨基酸序列比对,根据序列比对和结构解析结果,我们选择了N175、V237、I350、Y352共4个位点作为定点突变位点,分别将175位的极性的天冬酰胺突变为酸性的谷氨酸(E175)；237位的非极性的氨基酸缬氨酸突变为酸性的谷氨酸(E237)；350位的非极性的氨基酸异亮氨酸突变为极性不带电荷的氨基酸丝氨酸(S350)；352位的极性不带电荷的氨基酸酪氨酸突变为非极性的氨基酸苯丙氨酸(F352)。通过对突变体蛋白的酶学特性分析发现：突变体OFdadX-N175E最适反应pH为9.6,OFdadX-V237E最适反应pH为11,OFdadX-I350S最适反应pH为12；突变体OFdadX-N175E最适反应温度为30℃、OFdadX-V237E最适反应温度为30℃、OFdadX-I350S最适反应温度为40℃。稳定性试验结果显示所获得的4个突变体中突变N175E和I350S的热稳定性和pH稳定性比野生型有所降低。Y352F的底物特异性除最适底物与野生型相同外,其它底物差异较明显。选定pH稳定性减弱的N175E位点进行饱和突变,构建饱和突变文库,并通过Microplate reader筛选得到活性进一步提高的突变体N175S、N175D、N175R,并经亲和层析纯化得到单一蛋白。