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维生素E是一类脂溶性抗氧化剂的统称,可分为生育酚和生育三烯酚两大类,它们对于人体的营养健康具有重要意义。维生素E只能在光合自养生物（如高等植物和蓝藻）中合成。人体日常所需的维生素E主要是通过植物类食物和药物来补充。生菜是一种被广泛食用的蔬菜,利用遗传工程的方法改良生菜维生素E的合成途径,并提高维生素E的含量,对于提高其营养价值具有重要的现实意义。本文选择常见生菜品系Lactuca sativa L. var. longifolia（romaine lettuce,罗蔓生菜）作为研究对象,探索维生素E生物合成途径上的三个关键酶:4-羟苯丙酮酸二加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD）、尿黑酸植基转移酶（homogentisate phytyltransferase,HPT）和γ-生育酚甲基转移酶（γ-tocopherol methyltransferase,γ-TMT）对生菜维生素E合成途径的影响。具体工作包括以下四个方面:1.生菜LsHPPD和LsHPT基因的克隆及分析。从生菜中克隆了编码4-羟苯丙酮酸二加氧酶和尿黑酸植基转移酶的基因,LsHPPD和LsHPT（GenBank登录号分别为FJ194493和FJ194492）。LsHPPD基因的cDNA序列全长1,743 bp,编码一个含446个氨基酸的蛋白质。通过蛋白质氨基酸序列多重比对发现,LsHPPD与蒺藜苜蓿HPPD序列具有77%的同源性。已知HPPD需要与Fe2+相互作用才能具备正常的催化活性,根据蛋白质序列分析以及三维结构预测的结果,推测出LsHPPD的His-222、His-304和Glu-390是其与Fe2+相互作用的氨基酸残基。LsHPT基因的cDNA序列全长1,670 bp,编码一个含395个氨基酸的蛋白质。LsHPT与拟南芥HPT具有68%的同源性。据报道拟南芥和菠菜的HPT蛋白质都定位于叶绿体膜表达。在对LsHPT的氨基酸序列进行分析时发现:LsHPT是一种具有高度疏水性的蛋白质,在其N端有一段75个氨基酸的叶绿体定位信号序列,推测LsHPT蛋白可能也定位于叶绿体膜表达。Southern blot分析表明这两个基因在生菜基因组中都是以低拷贝形式存在的。组织表达分析结果表明,LsHPPD和LsHPT基因在种子中的表达量最高,在第5-10片叶片中次之,在第1-2片叶片、根、子叶和茎中表达量较低。在LsHPPD和LsHPT基因表达水平较高的组织中生育酚总量一般也相对较高。对生菜分别进行强光、干旱及低温等胁迫处理以及茉莉酸甲酯、脱落酸等激素诱导后发现,LsHPPD和LsHPT基因的表达量和生育酚含量均显著提高。上述结果表明,LsHPPD和LsHPT基因对于不同组织中以及不同胁迫诱导条件下生菜维生素E的合成具有关键作用。2. LsHPPD和LsHPT基因在生菜中的瞬时表达分析。为了进一步研究LsHPPD和LsHPT基因对生菜维生素E合成的影响,采用农杆菌渗入法（Agroinfiltration）对生菜进行瞬时转化,使生菜中LsHPPD和LsHPT基因的表达量在短时间内迅速提高。实时荧光定量RT-PCR的结果表明,LsHPPD和LsHPT基因表达量(用2-ΔΔCt值表示)分别达到对照的13.18倍和12.47倍。HPLC检测结果表明LsHPPD基因的瞬时表达可使α-生育酚的含量提高到25.57±1.37μg/g FW,为对照的5.37倍;LsHPT基因的瞬时表达可使α-生育酚的含量提高到88.44±3.15μg/g FW,为对照的18.58倍。瞬时表达的结果表明,提高LsHPPD和LsHPT基因的表达水平可以促进生育酚的合成,其中LsHPT基因在提高生育酚含量方面的作用效果又要优于LsHPPD基因。3. LsHPPD和LsHPT基因在拟南芥和生菜中的稳定表达分析。在瞬时表达的基础上,为了研究LsHPPD和LsHPT基因的稳定转化对于维生素E合成途径的影响是否与之相似,采用LsHPPD和LsHPT基因对拟南芥进行遗传转化。在获得的表达LsHPPD和LsHPT基因的转基因拟南芥植株中,α-生育酚和γ-生育酚的总量可分别提高到野生型植株的1.51倍和2.09倍,说明LsHPPD和LsHPT基因的稳定转化可以促进植株中维生素E的合成。继而将LsHPPD和LsHPT基因用于生菜的遗传转化,以期提高其中生育酚的含量,从而改善生菜的营养品质。结果表明:在过量表达LsHPPD基因的生菜中,α-生育酚和γ-生育酚的总量提高至11.57±0.39μg/g FW,是野生型植株的1.70倍;在过量表达LsHPT基因的生菜中,其总量可提高至17.77±0.41μg/g FW,是野生型植株的2.61倍。在T1代转基因植株中,目的基因的表达量和生育酚含量仍保持较高的水平,表明其具有遗传稳定性。4.拟南芥AtHPT和AtTMT双基因共转化生菜的研究。过量表达LsHPPD和LsHPT基因,尤其是其中的LsHPT基因,可以提高生菜中α-生育酚和γ-生育酚的总量。然而这两个基因的过量表达却无法改变生菜中生育酚的组成。将AtHPT和AtTMT基因构建双基因共转化载体,对生菜进行遗传转化。结果表明在转基因生菜中,生育酚总量可提高至13.62±0.26μg/g FW,α-生育酚:γ-生育酚的比值提高至4.24,最终可使维生素E活性提高到对照的3.51倍。因而通过同时过量表达AtHPT和AtTMT基因可以使生育酚总量和其中α-生育酚所占的比例都有所提高,从而提高生菜中总维生素E的活性。本文成功克隆了生菜LsHPPD和LsHPT基因,并通过农杆菌介导的遗传转化分别获得生菜及拟南芥的转基因植株,使其中维生素E的含量和活性都显著提高。为后续进一步改良生菜的维生素E合成途径,并提高总维生素E的活性奠定了必要的前期基础。