丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染是全球性严重的健康问题，目前约有1.3~1.7亿人群感染HCV，其中70%~80%的患者发展为慢性。病毒持续感染，部分患者可发展为终末期肝病，如肝硬化和/或肝细胞癌。经过聚乙二醇化干扰素（Pegylated interferon，Peg-IFN）-联合利巴韦林的标准化抗病毒治疗，可使约55%人群获得持续性病毒学应答（sustained virological response, SVR）。因此，充分认识IFN-抗病毒机制尤为重要。IFN-直接抑制病毒复制外，还通过调节机体免疫活性清除HCV感染肝细胞，然而，IFN-抗HCV免疫的潜在分子机制尚需进一步阐明。机体免疫应答在抑制病毒复制和疾病进展中发挥着重要作用。自然杀伤细胞（natural killer cells, NK）作为机体固有免疫系统中的重要组分，通过细胞毒性和分泌抗病毒因子如，IFN-γ等，在早期控制病毒感染。在急慢性HCV感染过程中，NK细胞参与了抗病毒免疫；多数学者认为，慢性HCV感染中NK细胞处于免疫抑制状态，机制尚未完全清楚。CD100，又称Sema4D，组成性表达于NK细胞和静息T细胞。作为粘附分子，CD100通过与受体结合，增强效应细胞与靶细胞间粘附，对NK细胞功能进行免疫调节。然而，目前尚无关于CD100在慢性HCV感染中研究的实验室证据。本研究选取75例慢性HCV感染者（未治疗30例，应用标准化抗病毒治疗后获得早期病毒学应答者25例，获得SVR者20例）为研究对象。主要采用流式细胞术包膜染色检测外周血NK细胞膜上CD100、CD69和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand, TRAIL）表达水平；以及采用ELISA检测血清中可溶性CD100（soluble CD100, sCD100）水平。体外观察了HCV感染和IFN-刺激对CD100及受体Plexin-B1/B2表达影响，并通过阻断CD100-Plexin-B1/B2结合，观察NK细胞杀伤活性变化，探讨IFN-介导抗病毒免疫的潜在分子机制及作用模式。主要研究内容和方法：1.慢性丙型肝炎患者NK细胞CD100表达及意义有研究报道，在免疫缺陷病毒及汉坦病毒感染过程中，CD100参与了机体免疫调节，但目前尚无HCV感染和CD100研究的相关报道。我们主要采用流式细胞术观察了慢性HCV感染者（30例未治疗患者）NK细胞、亚群分布以及NK细胞膜分子CD100，CD69和TRAIL表达水平变化；同时，采用ELISA法检测了慢性HCV感染者血清中sCD100水平。并采用Spearman相关检验分析了NK细胞膜分子与临床指标，谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）及HCV RNA水平之间的相关性。2. HCV及IFN-对CD100及受体Plexin-B1/B2表达影响病毒感染可诱导NK细胞活化性受体（NKG2D等）的配体在靶细胞表达，促进NK细胞活化，发挥杀伤功能。众所周知，IFN-是抗HCV感染治疗药物的主要组分，但是其通过调节机体免疫发挥抗病毒作用的分子机制尚不清楚。因此，我们选用K562及Huh7.5细胞做为本部分实验的靶细胞，首先采用qRT-PCR及流式细胞术检测K562及Huh7.5细胞是否表达CD100受体, Plexin-B1/B2。然后，体外采用不同感染复数（1,10,100）的HCV及不同浓度（0.01，0.1,1,10,100,1000ng/ml）的IFN-分别刺激健康人外周血单个核细胞（PBMC）和Huh7.5细胞,在不同时间点观察CD100及其受体Plexin-B1/B2表达水平的变化。3.探索IFN-调节NK细胞功能的分子作用机制既往研究报道，IFN-通过增强NK细胞功能，发挥抗HCV作用，但是相关分子机制尚不明确。我们首先采用流式细胞术观察了接受Peg-IFN-α联合利巴韦林治疗，获得EVR及SVR者，外周血NK细胞及亚群分布以及CD100，CD69及TRAIL在NK细胞表达变化；同时观察了血清中sCD100水平变化，并分析了CD100，TRAIL与病毒学应答的关系。体外采用K562，Huh7.5及HCV感染的Huh7.5细胞作为靶细胞，与分离的健康人NK细胞共培养12h，在IFN-刺激下，观察NK细胞功能变化；同时采用CD100阻断实验，观察NK细胞毒性及细胞因子IFN-γ分泌变化，探索CD100与其受体结合在调节NK细胞杀伤靶细胞过程中的作用。主要研究结果如下：1.慢性HCV感染者外周血中NK细胞亚群分布异常，表现为CD56dimNK亚群比率显著下降，“失能”的CD56negNK亚群异常增殖。2.慢性HCV感染者血清中sCD100水平较健康对照者显著降低；NK细胞CD100、CD69和TRAIL表达轻度异常，但无统计学差异。3.慢性HCV感染者NK细胞CD100及TRAIL表达分别与谷丙转氨酶水平呈正相关，而与HCV-RNA滴度呈负相关。4.体外HCV感染及IFN-治疗均显著影响CD100及其受体Plexin-B1/B2表达。5.慢性HCV感染者经过有效的IFN-抗病毒治疗后获得EVR者，NK细胞CD100、CD69和TRAIL表达显著上调，sCD100血清水平升高；获得SVR的患者，异常分布的NK细胞亚群、血清中sCD100及三种膜分子表达均恢复正常水平。6. HCV可增强NK细胞毒性，表现为CD107a表达升高，而对IFN-γ分泌无显著影响；对不同靶细胞（K562、Huh7.5及HCV感染的Huh7.5细胞）应答过程中，IFN-显著增强NK细胞杀伤活性，包括毒性及细胞因子分泌功能。7.阻断CD100与Plexin-B1/B2结合，明显抑制NK细胞功能，表现为CD107a及IFN-γ表达下调。综上所述，我们发现HCV感染通过下调NK细胞CD100表达，降低效应细胞与靶细胞间接触，抑制对靶细胞杀伤和病毒清除。根据慢性HCV感染者CD100与ALT、HCV-RNA水平之间相关性，推测CD100可能参与了免疫介导的肝脏炎症发生和病毒控制。在NK细胞对靶细胞免疫应答中，IFN-治疗通过上调CD100、TRAIL、CD107a和IFN-γ等分子表达，促使NK细胞活化，增强了对病毒感染肝细胞的杀伤，有助于清除HCV。探讨其机制，发现CD100与受体Plexin-B1/B2结合在调节NK细胞功能中发挥了关键作用，为研制抗HCV感染新的药物靶点提供了实验和理论依据。