【摘 要】
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为此,该研究首先利用从HCV感染患者中获得的多个含有不同长度PolyU/UC段的3NCR cDNA克隆构建含报道基因的重组质粒,建立检测3NCR对IRES介导翻译的调节作用的报道系统和细胞内
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为此,该研究首先利用从HCV感染患者中获得的多个含有不同长度PolyU/UC段的3NCR cDNA克隆构建含报道基因的重组质粒,建立检测3NCR对IRES介导翻译的调节作用的报道系统和细胞内HCV多聚酶活性检测系统:即将含有HCV IRES、荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)报道基因和内含不同长度PolyU/UC段及缺如PolyU/UC段的3NCR序列插入pcDNA3.1 mycHisA载体,构建系列重组质粒(p5cF、p5cFCl-C5、p5cFVX等),通过Fluc蛋白的表达水平分析3NCR及其PolyU/UC段对IRES介导翻译的调节作用.同时将HCVIRES、荧光素酶Fluc报道基因和内含不同长度PolyU/UC段的3NCR序列反向插入pcDNA3.1mycHisA载体,构建细胞内检测HCV多聚酶活性的翻译单位,通过细胞内Fluc蛋白的表达水平分析3NCR对多聚酶合成RNA的影响.为研究3NCR在IRES介导翻译中的调节作用,分别在体外翻译体系和细胞中分析了系列重组质粒的Fluc蛋白表达水平,实验结果提示HCV全长3NCR在体外和细胞内对IRES介导的翻译均有增强作用,并与其中PolyU/UC段的长度不成正比.进一步研究分析了3NCR的PolyU/UC段对IRES介导翻译的调控作用,发现细胞实验和体外翻译实验结果不一致.细胞实验中含有PolyU/UC段重组质粒翻译得到的Fluc蛋白水平是缺如PolyU/UC段重组质粒(p5cFVX)翻译所得Fluc蛋白的8-12倍,提示3NCR的PolyU/UC段对IRES介导的翻译具有增强作用;而在体外翻译体系中,含有PolyU/UC段重组质粒翻译得到的Fluc蛋白水平仅为缺如PolyU/UC段重组质粒(p5cFVX)翻译所得的1/2.综上所述,该研究应用体外翻译和细胞转染实验分析了HCV 3NCR在IRES介导翻译中的作用及对NS5B多聚酶合成RNA的影响,发现自然来源的内含不同长度PolyU/UC段的3NCR对IRES介导的翻译具有增强作用,而对多聚酶的复制活性具有抑制作用;进一步研究发现细胞蛋白参与3NCR的PolyU/UC段对IRES介导翻译的增强调节作用.研究结果为深入探讨HCV基因复制和病毒蛋白翻译机制、研究病毒与宿主蛋白的相互作用打下了基础.
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