论文部分内容阅读
[目 的]对三种不同淋巴结转移状态的宫颈癌组织标本（淋巴结转移（N+）:3例;淋巴脉管侵犯（LVSI）:3例;淋巴结未转移（N0）:3例）进行全转录组测序,并从中筛选出差异表达基因（DEGs）,最终得到血管抑制素-2（Vasohibin-2,VASH2）;然后通过生信分析对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因表达组学数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中宫颈癌淋巴结转移相关的高通量微阵列测序数据进行分析,同时通过ceRNA机制和在线工具预测,得到可能调控VASH2的上游miRNA——miR-106a-5p。进一步在宫颈癌细胞系、N+和NO的宫颈癌组织标本中检测miR-106a-5p和VASH2的表达水平,并在宫颈癌细胞系中研究VASH2对细胞增殖和转移能力的影响,最后探索VASH2基因促进宫颈癌细胞增殖和转移的潜在分子机制。[方 法]1、分别对3例N+、3例LVSI、3例NO的宫颈癌组织通过全转录组测序的方法检测差异基因等表达情况,再运用生物信息学方法在GEO数据库和TCGA数据库中加以验证,获得宫颈癌组织N+和NO之间的差异表达基因（DEGs）,并从中筛选出参与血管生成的基因VASH2,最后通过在线工具的预测,得到可能调控 VASH2 的 miRNA——miR-106a-5p;2、收集2019年6月-2019年11月间在昆明医科大学第三附属医院接受手术治疗的宫颈癌患者术后组织标本;3、运用RT-qPCR和Western-blotting分别在多种人宫颈癌细胞系（Hela、C-33A、Ca Ski、SiHa、MS751）和正常宫颈上皮细胞系（HcerEpic）以及6例N+和6例N0的宫颈癌组织中检测VASH2的mRNA和蛋白表达水平,以及miR-106a-5p的表达水平;4、在上述6例N+和6例N0宫颈癌组织中使用免疫组化染色法（IHC）检测VASH2的蛋白表达水平;5、结合VASH2在宫颈癌细胞系中的表达情况,使用慢病毒稳定表达载体构建外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞系和对照细胞,以及干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞系和对照细胞;6、在上述外源性过表达VASH2和干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞系及其对照细胞中运用CCK-8实验检测细胞的增殖能力,运用划痕实验检测细胞的迁移能力,运用Transwell实验检测细胞的侵袭能力,运用淋巴管形成实验检测细胞形成新生淋巴管的能力;7、在上述外源性过表达VASH2和干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞系及其对照细胞中运用Western-blotting检测上皮细胞间质化（EMT）过程关键分子的表达情况,运用RT-qPCR检测TGF-β的表达情况,探索VASH2促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成的潜在分子机制。[结 果]1、9例样本的全转录组测序结果分析获得了 8类差异表达趋势和48个差异趋势基因,其中VASH2在N0、LVSI、N+组织中的mRNA表达量逐渐升高且差异具有统计学意义。在对GEO数据库中的GSE26511微阵列数据集分析后发现与宫颈癌NO组织相比,VASH2在宫颈癌N+组织中的表达显著上调且差异具有统计学意义;在对TCGA数据库中宫颈癌NO和N+组织数据分析后发现VASH2在宫颈癌N+的组织中的表达显著上调且差异具有统计学意义。最后利用ceRNA机制和在线软件TargetScan预测得到可能靶向调控VASH2的上游miRNA,其中miR-106a-5p保守性高且参与调节EMT途径,最有可能在宫颈癌中调控VASH2的表达;2、共收集符合入排标准的宫颈癌术后组织样本76例,其中N+组织样本17例,NO组织样本59例;3、miR-106a-5p在宫颈癌细胞株C-33A、Ca-Ski和SiHa表达水平相对于正常宫颈上皮细胞系HcerEpic均显著上调且差异具有统计学意义;VASH2在Ca Ski、SiHa和M751细胞中的mRNA和蛋白表达水平相对于HcerEpic均显著上调且差异具有统计学意义;相对于NO组织,N+组织中miR-106a-5p的表达水平无明显差异;相对于NO组织,N+组织中VASH2的mRNA和蛋白表达水平均显著上调且差异具有统计学意义;4、VASH2在6例N+组织中均有表达且染色强度深,阳性细胞比例高,而在6例NO组织中则几乎不表达;5、根据VASH2在宫颈癌细胞系中的表达情况,我们成功构建了外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞系HeLa-VASH2和对照细胞HeLa-VASH2-vector;同时成功构建了内源性干扰VASH2表达的宫颈癌细胞系Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2,MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 和对照细胞Ca Ski-VASH2RNAi-vector、MS751-VASH2RNAi-vector;6、CCK-8实验发现HeLa-VASH2细胞活力较HeLa-VASH2-vector明显增强,而 Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2 和 MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 细 胞 活 力 较 Ca Ski-VASH2RNAi-vector 和MS751-VASH2RNAi-vector则明显减弱;划痕实验发现HeLa-VASH2细胞迁移能力较 HeLa-VASH2-vector 明显增强,而 Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2 和 MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 细胞迁移能力较 CaSki-VASH2RNAi-vector 和 MS751-VASH2RNAi-vector 则明显减弱;Transwell实验发现HeLa-VASH2细胞侵袭能力较HeLa-VASH2-vector明显增强,而 Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2;和 MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 细胞侵袭能力较 CaSki-VASH2RNAi-vector 和MS75 1-VASH2RNAi-vector 则明显减弱;7、E-cadherin在HeLa-VASH2细胞中的蛋白表达水平明显低于HeLa-VASH2-vector,而在 Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2 和MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 中的蛋白表达则明显高于CaSki-VASH2RNAi-vector 和 MS751-VASH2RNAi-vector;相反地,N-cadherin、Vimentin和VEGF-C在HeLa-VASH2细胞中的蛋白表达则水平明显高于HeLa-VASH2-vector,而在 Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2 和MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2中的蛋白表达水平则明显低于CaSki-VASH2RNAi-vector 和 MS751-VASH2RNAi-vector;TGF-β在 HeLa-VASH2细胞中mRNA表达水平明显高于HeLa-VASH2-vector,而在Ca Ski-VASH2RNAi#1、Ca Ski-VASH2RNAi#2;MS751-VASH2RNAi#1、MS751-VASH2RNAi#2 中的mRNA 表达水平则明显低于CaSki-VASH2RNAi-vector 和 MS751-VASH2RNAi-vector。[结 论]1、VASH2在宫颈癌细胞系Ca Ski、SiHa和M751中表达水平相对于正常宫颈上皮细胞HcerEpic呈明显上调,且在宫颈癌N+组织中的表达相对于NO组织呈明显上调,提示VASH2可能参与宫颈癌淋巴结转移的调控;2、miR-106a-5p在宫颈癌细胞系C-33A、Ca-Ski和SiHa中中表达水平相对于正常宫颈上皮细胞HcerEpic呈明显上调,但在NO组织和N+组织间表达并无差异,提示miR-106a-5p可能在宫颈癌中不能调控VASH2,也不参与宫颈癌淋巴结转移的调控;3、VASH2在宫颈癌细胞中可能是通过TGF-β通路介导的EMT途径促进细胞的增值、迁移、侵袭和淋巴管形成。