志贺菌(Shigella)是一类兼性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，于19世纪末被公认为菌痢或志贺氏痢疾的病原体，主要通过粪—口传播，侵入结肠粘膜，由于细菌数少至10个即可致病，因此严重威胁着卫生条件不良的发展中国家的公共卫生。志贺菌的感染以结肠上皮的破坏和急性结肠炎为其共同致病性特征，研究显示志贺菌侵入上皮细胞的能力为其毒力所必需，因此抑制或降低志贺菌的毒力是治疗由其引起的感染的策略之一。目前志贺菌的耐药性日趋严重，迫切需要开发新型的有效药物。近年来，细菌双组分信号转导系统作为新型药靶受到越来越多的关注，尤其是与生长及毒力或耐药相关的双组分信号转导系统，但是目前对志贺菌双组分信号转导系统的研究较少。 为了研发可降低志贺菌毒力的先导化合物，本研究以已公布的5株志贺菌株的全基因组序列为基础，采用生物信息学技术对志贺菌的双组分信号转导系统进行了分析，并选取其中与志贺菌毒力相关的PhoQ/PhoP和EnvZ/OmpR 的组氨酸蛋白激酶(PhoQ和EnvZ)分别作为筛选药物的靶标，进行蛋白三维模建，进而在小分子化合物库中通过高通量虚拟筛选，筛选出候选PhoQ抑制剂和候选EnvZ抑制剂，在此基础上，采用检测小分子抑制剂对相应酶的抑制活性的方法，分别筛选出PhoQ抑制剂和EnvZ抑制剂，并检测其对志贺菌毒力的抑制活性，为研发治疗志贺菌感染的新型药物奠定基础。 第一章志贺菌双组分信号转导系统的生物信息学分析鉴于双组分信号转导系统(Two-Component Signal Transduction Systems，TCSTSs)对志贺菌(Shigella)毒力具有重要的调控作用，我们对已完成全基因组序列测定分析的5株菌株：痢疾志贺菌197株、福氏志贺菌301株和2457T株、鲍氏志贺菌227株、宋内氏志贺菌046株的双组分信号转导系统进行了生物信息学分析。在所研究的5株志贺菌的基因组中，双组分信号转导系统的数目相差较大，组氨酸蛋白激酶(Histidine Kinase，HK)由19个到28个，反应调节蛋白(Response Regulator，RR)由23个到30个不等；而且与大肠杆菌相比，这5株志贺菌中双组分信号转导系统的数目都较少，考虑到志贺菌基因组含有大量假基因的特点，况且在所发现的TCSTSs的编码基因中，部分为TCSTSs 的假基因，因此我们认为假基因是导致双组分信号转导系统的数目在志贺菌各菌株之间以及与大肠埃希菌之间具有差异的原因之一。进而，通过对组成双组分信号转导系统组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白的功能域分别进行分析，根据不同的功能域组合进行分类，得到了12组HK和7组RR。HATPase_c功能域和REC 功能域分别是．HK和RR 的标志，其余 HisKA、PAS、HAMP、GAF、KDP、5TM-5TMR LYT和各类DNA结合功能域也存在于志贺菌的HK和RR 中。根据Forst S 提出的组氨酸蛋白激酶的分类标准，对志贺菌HK进行分类，发现含有所有的I～V类，其中I类在这5类占最大的比例(以sf301为例，24个HK中19个属于I类)，与其他革兰阴性菌的观察结果相符。在志贺菌RR中，4个保守性残基D1、D2、G和K的同源性较高，存在于所有RR中。 通过构建进化树的方法，根据各蛋白之间的亲缘关系将 HK 和RR 归于7个亚家族，并对成对的HK-RR 在基因组中的毗邻关系进行分析，发现大部分成对的HI-RR 由来源于同一进化家族的HK和RR组成，这种情况下的HK与其同源RR在基因组中的位置相邻的几率达87.5％；而在6对由来源于不同进化家族的HK和RR组成的成对HK-RR中，有5对的HK和RR在基因组中的位置是不相邻的。 目前在志贺菌中PhoQ/PhoP和EnvZ/OmpR 已有明确报道与其毒力密切相关，提示可以作为潜在的药靶进行研究。 第二章组氨酸蛋白激酶PhoQ抑制剂对福氏志贺菌毒力影响的研究根据上述对双组分信号转导系统的分析得知在志贺菌中PhoQ/PhoP 双组分信号转导系统与志贺菌的毒力密切相关，而PhoQ 通过感受外界Mg<2+>浓度的变化，对PhoP进行调控；因此我们选择在福氏志贺菌中研究PhoQ抑制剂对志贺菌毒力的影响，为研发治疗志贺菌感染的新型药物奠定基础。通过构建志贺菌PhoQ胞内段(SF-PhoQc)蛋白的原核表达质粒，表达并纯化重组SF-PhoQc蛋白，在SPECS公司的小分子化合物库中通过虚拟筛选得到64个候选PhoQ抑制剂的基础上，利用：Kinase-Glo Imminescent Kinase Assay 和组氨酸激酶．PK-LDH 酶活偶联测定法，筛选出5个能够有效抑制SF-PhoQe蛋白磷酸化的PhoQ 抑制剂(PhoQ-Inhibitors 1—5，半数抑制率浓度 IC<,50> 范围在7.99～69.37μmol/L)。进一步的研究采用表面等离子共振(SPR)技术测定出PhoQ抑制剂1—5与SF-PhoQc蛋白的结合力，其平衡解离常数(K<,D>)范围在2.56～10.6μmol/L，显示出与靶蛋白的强结合力。 为了检测志贺菌的毒力，我们采用BALB/c 小鼠构建小鼠角结膜志贺菌感染模型，并采用该模型检测PhoQ抑制剂对福氏志贺菌株Sf9380毒力的影响，其中化合物1、2和4能够明显抑制福氏志贺菌株。Sf9380导致的小鼠角结膜炎症反应(由+++变为-)，化合物3和5能够明显降低其炎症反应(由+++降为+)，化合物1、2、3、4、5降低．Sf9380引起的小鼠角结膜炎症的最小有效浓度分别为6.25μmol/L、25μmol/L、100μmol/L、25μmol/L 和25μmol/L。进而，我们采用志贺菌感染HeLa 细胞的模型，研究经化合物1、2、3、4和 5 处理对志贺菌毒力的影响，发现PhoQ抑制剂1、3和4能够降低．Sf9380对HeLa细胞的侵袭力，上述结果提示PhoQ抑制剂可降低福氏志贺菌的毒力，具有潜在的应用前景。 第三章组氨酸蛋白激酶EnvZ抑制剂对福氏志贺菌毒力影响的研究根据上述对双组分信号转导系统的分析得知在志贺菌中EnvZ/OmpR 双组分信号转导系统的作用是正向调控志贺菌的毒力，而EnvZ通过感受外界渗透压的变化，对OmpR进行调控；因此我们选择在福氏志贺菌中研究EnvZ抑制剂对志贺菌毒力的影响，为进一步研究和开发治疗志贺菌感染的新型药物奠定基础。 由于EnvZ蛋白序列在志贺菌与大肠埃希菌之间同源性达100％，而且本实验室的7个YycG抑制剂是以大肠埃希菌的EnvZ蛋白的NMR结构为模板进行表皮葡萄球菌YycG蛋白的三维模建之后通过多层筛选而得，因此我们以 YycG抑制剂作为候选的EnvZ抑制剂。通过构建志贺菌EnvZ胞内段(SF-EnvZc) 蛋白的原核表达质粒，表达并纯化重组SF-EnvZc 蛋白，在已有的7个候选EnvZ抑制剂的基础上，利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay 和组氨酸激酶-PK-LDH酶活偶联测定法，筛选出3个能够有效地抑制SF-EnvZc蛋白磷酸化的EnvZ 抑制剂(EnvZ．Inhibitors 1—3，半数抑制率浓度IC<,50>范围在2.25～70.17μmol/L)。进而，采用表面等离子共振技术检测出EnvZ抑制剂1—3与SF-EnvZc 蛋白的结合力，其平衡解离常数(K<,D>)范围在2.94～4.08μmol/L，提示与靶蛋白具有强结合力。为了检测志贺菌的毒力，我们采用BALB/c 小鼠构建小鼠角结膜志贺菌感染模型，并采用该模型检测EnvZ抑制剂对福氏志贺菌株．Sf9380 毒力的影响，其中化合物1和2能够明显抑制福氏志贺菌株Sf9380导致的小鼠角结膜炎症反应(由+++变为-)，化合物3能够明显降低其炎症反应(由+++降为+)，化合物1、2、3 降低Sf380 引起的小鼠角结膜炎症的的最小有效浓度分别为12.51μmol/L、12.5μmol/L 和100μmaol/L。我们进一步采用志贺菌感染HeLa 细胞的模型研究经EnvZ抑制剂1、2、3处理对志贺菌毒力的影响，结果发现EnvZ抑制剂 1 能够明显降低Sf9380的侵袭力，抑制活性呈剂量依赖，在100μmol/L 浓度时使Sf9380对HeLa 细胞的侵袭率由0.121％下降至0.018％。结果提示EnvZ抑制剂可降低福氏志贺菌的毒力，具有潜在的应用前景。 通过上述研究筛选到能够不同程度降低志贺菌毒力的先导化合物，其中为5个PhoQ抑制剂和 3 个EnvZ抑制剂，为研究防治志贺菌感染的新型药物提供了新的依据。