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肌肉和脂肪组织是牛肉的主要组成部分,为此,发掘调控牛肌肉与脂肪生成的关键基因,对提高牛肉品质和肉牛生长发育性状具有重要意义。目前已知大量编码蛋白的基因对肌肉与脂肪的发育具有重要调控作用,例如:调控肌肉发育关键基因Myo D和My HC,调控脂肪生成的关键转录因子C/EBPα和PPARγ,以及同时对肌肉和脂肪的发育具有调控作用的Sirt1和Klf5等。近年来,越来越多的具有调控功能的长链非编码RNA（lnc RNA）被揭示,但大多数与肌肉、脂肪发育相关的研究只是利用测序的方法揭示一些候选lnc RNAs,对候选lnc RNAs功能的研究相对较少。因此,本研究以牛为研究对象,从实验室前期测序结果中筛选出候选lnc RNA,并利用RACE、生物信息学分析、原核表达、双荧光素酶报告系统和q RT-PCR等现代生物技术,对肌肉与脂肪发育相关lnc RNA lnc FAM200B进行鉴定、启动子活性及遗传变异研究,以期为深入探讨lnc RNA的功能与作用机制奠定基础,为提高牛肉品质与生长发育性状等提供科学资料。1.牛长链非编码RNA lnc FAM200B的全长克隆、鉴定与表达规律研究本实验室前期转录组测序结果显示,新lnc RNA lnc FAM200B在秦川牛胎牛、犊牛、成年牛肌肉组织中差异表达。本试验利用RACE对lnc FAM200B的序列特征进行研究,获得了lnc FAM200B共472 bp的全长序列;原核表达分析显示lnc FAM200B不具备蛋白编码的能力;生物信息学预测结果显示:lnc FAM200B启动子区3000 bp序列中包含30个C/EBPα和7个CEBPβ等与脂肪细胞生成相关的转录因子结合位点,43个SP1转录因子潜在的结合位点,其中,SP1富集区域易与肌肉发育相关转录因子Myo D结合。lnc FAM200B在肌肉和脂肪中的表达分析显示lnc FAM200B在秦川牛犊牛肌肉中的表达水平显著低于在胎牛、成年牛肌肉中的表达水平。与此同时,在犊牛、成年牛脂肪中的表达水平均高于在同一时期肌肉中的表达水平。这些研究结果表明lnc FAM200B可能影响牛肌肉与脂肪发育。2.牛长链非编码RNAlncFAM200B基因启动子活性研究生物信息学预测发现牛lnc FAM200B基因可能与脂肪与肌肉发育相关,因此,本研究利用人胚肾293T、小鼠成肌细胞C2C12和前脂肪细胞3T3-L1细胞系,通过构建并转染包含lnc FAM200B启动子不同截短体的p GL3-Basic重组质粒并检测双荧光素酶活性,进一步分析lnc FAM200B基因启动子区的活性区域。结果显示,在293T、C2C12、3T3-L1三种细胞系中,不同截短体对应的荧光强度的变化趋势是一致的,从p GL3-pro4（-403）缩短到p GL3-pro5（-139）的过程中,荧光活性出现了极显著的降低（P<0.01）,提示转录起始位点之前-403至-139 bp之间为启动子活性区域。对不同细胞系中的荧光活性进行分析时发现,不同截短体在三种细胞系中的活性依次为293T<C2C12<3T3-L1（P<0.01）。lnc FAM200B的启动子活性在3T3-L1细胞中最强,其次是在C2C12细胞中,与lnc FAM200B在肌肉、脂肪中的表达水平一致。对启动子活性区域结合的转录因子进行预测发现,264 bp的活性区域中有6个与肌肉发育相关的转录因子SP1潜在的结合位点,2个与脂肪发育密切相关的C/EBPα潜在的结合位点。这些结果提示lnc FAM200B可能对牛肌肉和脂肪的发育具有一定的调控作用。3.牛长链非编码RNAlnc FAM200B基因遗传变异及其遗传效应研究肌肉和脂肪的发育是影响个体生长发育的主要原因,因此,本研究进一步从群体水平上分析lnc FAM200B基因单核苷酸多态性（SNP）与牛生长相关性状的关系。DNA测序发现南阳牛lnc FAM200B基因第1内含子存在1个SNP突变（AC000163:g.2472 T>C,Taq I）;利用PCR-RFLP方法鉴定145头南阳牛个体的基因型,结果显示:TC基因型的频率最高（0.57）,CC基因型的频率最低（0.02）。关联分析结果表明,该遗传变异位点不同基因型与6月龄南阳牛的体重、体高、体斜长、日增重等4个生长发育性状显著相关（P<0.05）,与12月龄的体高和体斜长显著相关（P<0.05）。该结果为进一步研究lnc FAM200B基因在生长发育过程中的功能奠定了基础,并为提高牛肉品质与生长发育性状的标记辅助选择（MAS）育种提供基础材料。