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目的:通过石斛酚对于链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的C57BL/6J小鼠糖尿病模型,以及高糖和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)环境下培养的猴视网膜脉络膜血管内皮细胞(Rhesus retinal vascular endothelial cells,RF/6A)体外模型的干预作用,探究石斛酚对糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)TNF-α/NF-κB通路的影响。方法:1体内实验:利用STZ诱导雄性C57BL/6J小鼠糖尿病模型,采用随机数字表法分为四组,正常对照组(Control组,n=15)、糖尿病组(DM组,n=15)、糖尿病+3mg/kg石斛酚给药组(n=15)、糖尿病+30mg/kg石斛酚给药组(n=15),造模成功后继续正常饲养8周,然后给予石斛酚腹腔连续注射1个月进行干预。利用HE染色观察小鼠视网膜各层结构形态;ELISA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α、IL-6蛋白表达;使用蛋白质免疫印迹法(Western Boltting,WB)检测石斛酚对小鼠视网膜组织中TNF-α/NF-κB信号通路中相关蛋白的影响;采用实时定量PCR检测技术(Real Time-PCR,RT-PCR),观察小鼠视网膜组织中促炎性因子TNF-α、IL-6、IL1-β的m RNA水平变化;免疫组化法观察石斛酚对小鼠视网膜组织中NF-κB蛋白的影响。2体外实验:(1)使用CCK-8试剂盒检测石斛酚对RF/6A细胞的增殖/毒性,设置0μM、0.625μM、1.5μM、3μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM的石斛酚浓度,选取适宜药物浓度范围。(2)利用双荧光素酶报告基因系统分析石斛酚是否能调控NF-κB的转录活性。(3)体外分别在高糖(30mmol/L)和TNF-α(5ng/ml)环境下培养RF/6A细胞。使用RT-PCR检测技术,观察石斛酚对高糖环境下RF/6A细胞中促炎性因子TNF-α、IL-6、IL1-βm RNA表达水平的影响;WB检测高糖和TNF-α环境下石斛酚对RF/6A细胞中TNF-α/NF-κB信号通路中IκBα、NF-κB p65及p-p65的影响。结果:1体内实验:(1)DM组小鼠视网膜HE染色显示视网膜分层欠清晰,视网膜内界膜肿胀、内外核层厚度减少,细胞排列紊乱,神经节细胞出现空泡样改变,不同剂量石斛酚给药组小鼠与DM组小鼠对比,视网膜组织分层较DM组清晰,内外核层数增加,细胞形态略规则、排列轻度紊乱,神经节细胞层肿胀减轻。(2)与Control组小鼠比较,DM组小鼠血清中TNF-α、IL-6明显升高;与DM组小鼠比较,不同剂量的石斛酚给药组均可以降低小鼠血清中TNF-α、IL-6的表达水平。(3)WB结果显示,与Control组小鼠比较,视网膜组织中TNF-α、NF-κB p65及其磷酸化p65蛋白的表达显著增加;与DM组小鼠比较,不同剂量的石斛酚给药组均可以抑制视网膜组织中TNF-α、NF-κB p65及其p-p65蛋白的表达。(4)RT-PCR结果显示,与Control组小鼠比较,视网膜组织中TNF-α、IL-6、IL1-β的m RNA表达水平显著升高;与DM组小鼠比较,不同剂量的石斛酚给药组能降低视网膜组织中TNF-α、IL-6、IL1-β的m RNA的表达水平。(5)免疫组化结果显示,NF-κB在小鼠视网膜组织中均呈阳性表达,但与Control组比较,DM组的NF-κB表达显著增加;不同剂量石斛酚治疗组与DM组比较,NF-κB表达均明显下降,且存在剂量依赖性关系。2体外实验:(1)CCK-8实验结果显示,石斛酚浓度低于50μM时对RF/6A细胞活性无抑制作用,石斛酚浓度为25μM时RF/6A细胞活性最高,选取5μM、10μM和25μM石斛酚浓度进行后续实验。(2)双荧光素酶报告基因系统结果显示石斛酚可以抑制NF-κB的转录活性。(3)RT-PCR结果显示,石斛酚可以下调高糖环境作用下RF/6A细胞内促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1βm RNA的表达。(4)WB结果显示,在高糖和TNF-α环境下石斛酚均能上调RF/6A细胞内IκBα蛋白的表达,下调NF-κB p65、p-p65蛋白的表达。结论:1石斛酚对DR小鼠视网膜具有保护作用的药效活性,其机制可能与TNF-α/NF-κB通路相关,并体现一定的剂量依赖性关系。2石斛酚的抗炎作用机制可能与抑制NF-κB的转录活性有关。3石斛酚具有类似TNF-α/IκBα/NF-κB信号通路抑制剂的功能,能够通过干扰TNF-α/IκBα/NF-κB信号传导,减轻高糖诱导的炎性损伤。