【摘 要】
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目的:探究自噬介导的乙脑重组DNA疫苗对小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响。研究方法:1.动物分组免疫选取清洁级健康雌性Balb/c小鼠（4-6周龄）,适应性饲养一周后,随机平均分成5组。取pJME-LC3质粒（1mg/ml,溶于无菌PBS）100μg分别肌注免疫鼠两左后肢股四头肌,共免疫3次,间隔2周,作为实验组;同时肌注pJME质粒（1mg/ml,溶于无菌PBS）100μg作为常规DNA疫苗免疫
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金项目（细胞自噬作用对提高乙型脑炎病毒疫苗长效保护性的研究:No.81501428）；
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目的:探究自噬介导的乙脑重组DNA疫苗对小鼠脾脏树突状细胞免疫功能的影响。研究方法:1.动物分组免疫选取清洁级健康雌性Balb/c小鼠（4-6周龄）,适应性饲养一周后,随机平均分成5组。取pJME-LC3质粒（1mg/ml,溶于无菌PBS）100μg分别肌注免疫鼠两左后肢股四头肌,共免疫3次,间隔2周,作为实验组;同时肌注pJME质粒（1mg/ml,溶于无菌PBS）100μg作为常规DNA疫苗免疫组,肌注pc DNA3.1（+）空载体作为阴性对照组,无菌PBS组作为空白对照组,免疫方式同前;此外,腹腔注射乙脑减毒活疫苗100μL/次（相当于1/5成人剂量）,作为阳性对照组。免疫动物所用质粒在注射前经Bam H I/Eco R I双酶切、酶切鉴定。2.pJME-LC3 DNA疫苗对树突状细胞功能的影响探究末次免疫后3周,Balb/c小鼠脱颈处死,无菌取脾分离脾淋巴细胞及DCs。通过Western Blot法检测免疫鼠DCs内LC3Ⅱ蛋白表达情况观察DCs自噬活性,同时通过间接免疫荧光法观察pr ME-LC3融合蛋白在免疫鼠脾DCs中同自噬体的定位关系;流式细胞术分析免疫鼠脾DCs表面MHCⅡ,CD80和CD86分子的表达;ELISA法检测DCs相关细胞因子分泌水平,CCK8法检测树突状细胞对T淋巴细胞的刺激增殖效果。结果:1.pJME-LC3促进免疫鼠DCs自噬活性,质粒编码蛋白在免疫鼠脾DCs中同自噬共定位pJME-LC3组DCs胞内LC3Ⅱ蛋白的表达增强,提示DCs胞内自噬活性增强。共聚焦显微镜下观察发现:pJME-LC3实验组DCs胞浆内质粒编码蛋白表达明显强于常规JE DNA疫苗对照的pJME组DC;同时可观察到pJME-LC3实验组DCs内自噬小体同融合蛋白共定位从而呈现黄色,pJME组DC胞内并未相互融合。2.pJME-LC3促进免疫鼠脾DCs表面MHCⅡ分子以及CD80,CD86的表达流式细胞术检测不同免疫组小鼠脾脏DCs表面标志分子的表达,以DCs中表达相应分子的阳性细胞所占比例进行比较。pJME-LC3实验组DCs中MHCⅡ和CD80分子的表达明显高于其他各组。pJME-LC3实验组DCs的CD86分子表达量显著高于pJME组,但与JEV-L组之间无统计学差异。3.pJME-LC3促进免疫鼠脾DCs Th1型细胞因子的分泌pJME-LC3实验组免疫鼠DCs分泌细胞因子IL-12（55.35±11.51）pg/m L,明显高于DNA疫苗常规对照组pJME（37.98±7.59）pg/m L和减毒活疫苗对照组JEV-L（36.46±6.64）pg/m L（**P<0.01）;pJME免疫组（5.063±0.3097）同JEV-L免疫组（5.173±0.2346）两者差异无统计学意义。4.pJME-LC3增强免疫鼠脾DCs对淋巴细胞的刺激增殖效果pJME-LC3实验组DCs刺激指数（6.09±0.20）明显高于pJME免疫组（5.06±0.31）*P<0.05)以及JEV-L免疫组（5.17±0.23）（**P<0.01）;pJME免疫组（5.06±0.31）同JEV-L免疫组（5.17±0.23）两者差异无统计学意义;空白对照PBS组（4.10±0.16）和空载体对照组（4.50±0.19）两者无统计学差异。结论pJME:1.pJME-LC3通过促进免疫鼠脾脏DCs自噬活性,增强质粒编码蛋白在DCs中的表达,提高脾脏DCs抗原提呈能力;2.pJME-LC3通过提增强脾脏DCs对脾脏淋巴细胞的刺激增殖能力,并提高了DCs Th1型细胞因子分泌水平,促进了pJME-LC3的免疫效果。
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