实验目的:1.研究SGK1对破骨细胞形成和功能的作用及其潜在的分子机制;2.观察腹腔注射SGK1抑制剂对卵巢切除模型小鼠骨质及其他组织的变化;3.筛选乳腺癌骨转移细胞系并建立骨转移动物模型,观察SGK1抑制剂对骨转移发生的作用。4.分析SGK1基因在乳腺癌患者中的差异表达及其与临床结果的关系。实验方法:1.利用RT-q PCR和Western Blotting等方法检测SGK1在RANKL诱导小鼠原代骨髓单核细胞（BMM）及小鼠单核细胞系RAW264.7向破骨细胞分化过程中的表达变化。应用TRAP染色,骨板吸收实验检测破骨细胞分化效率及功能。2.使用SGK1小分子抑制剂GSK650394,SGK1-sh RNA,SGK1-si RNA,抑制或沉默SGK1蛋白,基因或mRNA,干预RANKL诱导的破骨前体细胞分化过程。3.利用RT-q PCR和Western blotting等方法检测信号通路及转录因子表达变化。使用Western blotting,免疫荧光,Ca2+荧光探针检测Orai1蛋白表达量及通道功能变化。4.建立卵巢切除（OVX）小鼠模型,腹腔注射GSK650394,给药8周后收集小鼠胫骨、股骨,血清。股骨样本行Micro-CT扫描进行骨量分析,并切片行组织学分析,血清用于检测CTX,OPG,RANKL水平。5.筛选乳腺癌骨转移细胞系,建立骨转移小鼠模型。腹腔注射GSK650394,观察骨转移发生率及骨破坏情况。6.使用Oncomine和Onco Lnc数据库,检索分析SGK1在不同分型的乳腺癌患者中的表达差异以及其生存关系。实验结果:1.在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,SGK1的mRNA和蛋白水平显著升高,并且使用SGK1抑制剂可以有效降低破骨前体细胞分化效率以及破骨细胞的骨吸收功能。2.抑制SGK1的表达或功能后,NF-k B和PI3K/AKT信号通路以及破骨细胞相关转录因子NFATc1和c-Fos等被明显抑制。3.在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,Orai1的表达量升高,其介导的钙内流作用增强,过表达Orai1后破骨前体细胞的分化能力变强,并且这一现象可被GSK650394逆转。4.在OVX小鼠模型中,腹腔注射SGK1抑制剂可显著减少骨量丢失。在小鼠骨转移模型中,腹腔注射SGK1抑制剂可显著减少骨转移发生率。5.在乳腺癌患者中,SGK1的mRNA水平显著高于普通人。KM plotter基于大样本人群的生存分析显示,SGK1对乳腺癌患者的预后无显著影响,但在其他数据集GSE2603和GSE12276中,我们发现SGK1高表达可预测不良预后,提示SGK1具有潜在的致癌作用。实验结论:根据本研究的结果,SGK1表达增多在破骨细胞分化,骨吸收以及骨转移的过程中为重要的促进因素。通过上调NF-k B和PI3K/AKT通路,SGK1可以促进破骨前体细胞膜上的SOCE通道Orai1的丰度及活性,引起细胞内钙震荡(Ca2+oscillations),从而激活转录因子NFATc1和c-Fos,启动破骨细胞分化。SGK1抑制剂可能通过抑制破骨细胞发生及功能,或对肿瘤细胞直接的细胞毒作用减少骨转移的发生率。尽管,在本研究中通过不同数据库进行生存分析,SGK1对总的乳腺癌患者预后影响尚未明确（更确切地结论需要在调整混杂因素的特定人群队列中进行进一步的研究）,SGK1仍有望成为骨转移的治疗靶点。