第一部分广西人群β珠蛋白基因15个STR基因座的遗传多态性研究目的研究与β珠蛋白(β-globin,HBB)基因紧密连锁的15个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因座在广西人群中的遗传多态性,为建立β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的单体型分析技术(preimplantation genetic haplotyping,PGH)提供实验依据。方法采集广西地区150名无关个体的外周静脉血,提取外周血基因组DNA,通过荧光PCR技术扩增与β珠蛋白基因紧密连锁(距离HBB基因<1Mb)的15个STR基因座(HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338),扩增产物使用ABI3500Dx遗传分析仪进行毛细管电泳,结果用Genemaper 4.1软件进行分析。最后利用Microsoft Excel软件计算15个HBB-STR基因座的等位基因频率分布以及多态信息量(polymorphism information content,PIC)等。结果在这15个HBB-STR基因座(HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338)上分别检出18、24、22、11、18、27、13、13、16、23、22、16、17、18和7个等位基因,等位基因频率从0.003333到0.383333不等。这15个HBB-STR基因座的多态信息量(PIC)分别为0.8457、0.8983、0.8931、0.7592、0.8698、0.9046、0.7940、0.7925、0.7708、0.9102、0.8583、0.8467、0.7438、0.8366和0.7704。这15个基因座的PIC均>0.7000,平均值为0.8329,其中PIC>0.8500的HBB-STR基因座有6个。结论本研究检测的这15个HBB-STR基因座在广西人群中的多态信息量(PIC)较高,具有高度的遗传多态性,在建立β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的单体型分析(PGH)技术中具有较高的应用价值,为后续工作的开展提供了实验依据。第二部分β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断中不同诊断方法的比较目的对β地贫PGD中两种遗传学诊断方法——反向点杂交(reverse dot blot,RDB)结合STR单体型分析技术与二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术,从诊断时间、确诊率、费用等方面进行对比研究,建立最适宜的遗传学诊断技术应用于广西地区β地贫PGD。方法选择双方均为β地中海贫血基因突变携带者、有PGD指征且同意参加本研究的的夫妇。患者夫妇及另外三名家系成员(女方母亲、男方母亲和男方父亲)一同抽取外周静脉血进行15个STR位点的家系连锁分析。患者经过常规的药物促排卵、取卵、取精、卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、胚胎培养等程序,将所得胚胎全部进行囊胚培养,形成囊胚后,取囊胚期数个(5-8个)滋养外胚层细胞活检,活检后即将所有囊胚行玻璃化冷冻。利用多重置换扩增(Multiple displacement amplification,MDA)法对滋养外胚层细胞进行全基因组扩增(Whole genome amplification,WGA)。MDA扩增产物一部分采用反向点杂交(RDB)结合15个短串联重复序列(STR)位点的单体型分析(PGH)技术进行遗传学诊断(A组);另一部分MDA扩增产物采用二代测序(NGS)方法进行诊断(B组)。比较两种方法的检出率、诊断符合率、所需时间和费用等。待诊断结果出来后选择最合适的囊胚进行解冻移植。结果纳入本研究的患者获卵24个,胚胎13个,囊胚培养后形成6枚囊胚(囊胚评分分别为4BB,4BC,3CC,3CC,3BC,3CC),每个囊胚取滋养外胚层细胞活检,6例样本MDA法扩增均扩增成功,扩增成功率100%。A组中,囊胚1地贫基因型诊断结果为β-28/βCD41-42;囊胚2地贫基因型诊断结果为βCD41-42/βN;囊胚3地贫基因型诊断结果为βN/βN;囊胚4的地贫基因型诊断结果为β-28/βN/βN;囊胚5和6的地贫基因型诊断结果均为β-28/βN。B组的地贫基因型诊断结果与A组完全一致,B组同时对囊胚2-6进行染色体拷贝数检测,诊断出囊胚2为整倍体,囊胚3-6均为非整倍体。A组所需诊断时间为2-3天,结果分析所需时间约为1个工作日;B组所需诊断时间为2-3天,结果外送嘉宝仁和公司分析,所需时间为7个工作日。A组费用为2000元/囊胚,而B组费用为3500元/囊胚。最后选择囊胚2解冻移植,遗憾的是未获得临床妊娠。结论与二代测序(NGS)技术相比,反向点杂交结合STR单体型分析技术也能在β地中海贫血PGD中有效、准确地诊断出植入前囊胚的地贫基因型,能够应用于β地贫PGD临床。虽然目前二代测序价格昂贵、结果分析人员要求高,临床推广应用受限,但NGS是PGD遗传学诊断技术的发展方向和未来趋势。然而考虑到目前各方面条件的限制以及在广西地区开展β地贫PGD的急切需求,RDB结合15个STR位点单体型分析的诊断方法更加适合目前的广西地区β地贫PGD,值得推广应用。第三部分MDA结合RDB及STR单体型分析在β地贫PGD中的临床应用研究目的研究多重置换扩增(MDA)结合反向点杂交(RDB)及短串联重复序列(STR)单体型分析技术在β地贫PGD中的临床应用。方法纳入8对双方均为β地中海贫血基因突变携带者且要求进行β地贫PGD治疗的夫妇。携带者夫妇及其双方父母(每个家系一共6名成员)均抽取外周静脉血进行15个STR位点的家系连锁分析。患者经过常规的药物促排卵、取卵、取精、卵胞浆内单精子注射(ICSI)、胚胎培养等程序,将所得胚胎全部进行囊胚培养,形成囊胚后,取囊胚期数个(5-8个)滋养外胚层细胞活检,活检后即将所有囊胚进行玻璃化冷冻。利用多重置换扩增(MDA)法对取得的滋养外胚层细胞进行全基因组扩增(WGA)。MDA扩增产物采用反向点杂交(RDB)结合15个短串联重复序列(STR)位点的单体型分析(PGH)技术进行遗传学诊断。待诊断结果出来后,结合致病基因遗传学诊断结果和囊胚评分,选择最佳囊胚进行解冻移植,妊娠后孕18-22周通过羊水产前诊断进一步验证PGD诊断结果。结果这8对夫妇,β地中海贫血基因突变类型分别为CD41-42/N、CD17/N、-28/N或IVS-II-654/N。每个家系6名成员检测15个STR位点后结果显示每个家系均有7个或以上(HBB基因上游或下游均有2个以上)的STR位点可以提供诊断信息,单体型构建成功。患者经过常规药物促排卵,取卵、卵胞浆内单精子注射(ICSI)后共获得147枚胚胎,形成86枚囊胚,囊胚形成率58.50%。其中82枚囊胚扩增成功,扩增成功为95.35%。80枚囊胚获得了明确诊断,其中24枚囊胚为正常纯合子;38枚囊胚诊断为杂合子;18枚囊胚为不能移植的异常纯合子或双重杂合子。8例患者中一共4例患者进行了囊胚解冻移植(例1、例2、例3和例6),均为单囊胚移植。其中3例(例1、例2和例3)获得妊娠,1例(例6)未妊娠。妊娠率为75%(3/4)。例1和例2患者移植正常纯合子囊胚(基因型βN/βN),中孕期羊水产前诊断结果与PGD诊断结果相符。例3患者移植杂合子囊胚(基因型为βCD41-42/βN),移植后获得妊娠,但目前还未行产前诊断验证PGD诊断结果。结论本研究建立的β地贫PGD方法——即经多重置换扩增(MDA)后,反向点杂交(RDB)结合短串联重复序列(STR)单体型连锁分析,经验证有效、准确,可以在广西地区β地贫PGD临床中推广应用。我们期待着更大样本量的研究证实。