论文部分内容阅读
目的1、明确m6A及其修饰的LncRNA在硫酸镉（CdSO4）诱导胰岛β细胞NIT-1细胞损伤中的变化规律及相关性。2、探讨白僵蚕水提物（BBWE）对CdSO4诱导NIT-1细胞损伤的影响。方法1、构建CdSO4诱导NIT-1细胞的损伤:以CCK-8检测法、Hoechst染色法、荧光探针法以及氧化损伤指标检测方法,观察在不同浓度CdSO4（0、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM和64μM）染毒NIT-1细胞24 h后,细胞存活率的大小;在（0、1μM、2μM、4μM）CdSO4处理细胞24 h后,检测细胞凋亡水平、ROS含量、胰岛素水平、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。2、明确m6A修饰及其相关酶、LncRNAs在CdSO4致NIT-1细胞损伤中的变化规律:利用RT-PCR技术检测m6A甲基转移酶中甲基转移酶样3（METTL3）、m6A去甲基化酶中脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO）、m6A甲基结合蛋白中YTH蛋白家族成员（YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1）的m RNA水平和LncRNAs（LncRNA-MALAT1、LncRNA-PVT1、LncRNA-XIST、LncRNA-TUG1和LncRNA-NEAT1）的水平,蛋白免疫印迹实验检测m6A甲基转移酶中甲基转移酶样3（METTL3）、m6A去甲基化酶中脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO）、m6A甲基结合蛋白中YTH蛋白家族成员（YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1）的蛋白表达水平;以Epi Quick TM RNA甲基化定量试剂盒检测总RNA上的m6A修饰水平。3、探讨BBWE对CdSO4致NIT-1细胞损伤的影响:采用冷水浸泡法提取白僵蚕的水溶性成分,根据CCK-8检测法、Hoechst染色法和荧光探针法以及相关的氧化损伤试剂盒,首先检测BBWE（0、0.4 mg/m L、0.8 mg/m L、1.6 mg/m L、3.2 mg/m L和6.4 mg/m L）处理NIT-1细胞24 h后的细胞存活率,接着分别以0.4 mg/m L和0.8 mg/m L BBWE与4μmol/L CdSO4联合处理NIT-1细胞,检测细胞凋亡水平、ROS水平、蛋白水平、SOD活性和MDA含量,探讨BBWE对CdSO4诱导NIT-1细胞损伤的影响。结果1、CdSO4可诱导NIT-1细胞损伤:（1）细胞存活率:镜下观察到,不同浓度CdSO4（0、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM和64μM）染毒细胞24小时后,随着CdSO4浓度的升高,细胞呈阶梯性逐渐皱缩、变圆且贴壁能力减弱;CCK-8实验结果显示,各处理组细胞存活率分别为100.00%、90.66%、78.06%、70.76%、57.43%、45.23%、32.72%和23.21%,与对照组相比,各处理组差异均具有统计学意义（P<0.05）;（2）细胞凋亡率:荧光显微镜下可观察到,对照组细胞凋亡少、细胞核颜色呈均一蓝染,其余CdSO4处理组（1μM、2μM、4μM）的细胞凋亡逐渐增多、细胞核呈致密浓染或碎块状浓染,变白发亮,呈典型的凋亡形态;定量结果表明,对照组细胞凋亡率为3.47%,而CdSO4处理组的凋亡细胞分别为7.03%、17.23%和34.64%（P<0.05）;（3）细胞氧化损伤:荧光显微镜下可观察到,随CdSO4染毒浓度的增高,细胞内ROS水平逐渐升高;定量分析发现,1μM CdSO4处理组细胞ROS生成量是对照组的1.13倍,2μM和4μM CdSO4处理组细胞的ROS生成量分别是对照组的1.23倍和1.53倍,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;此外,1μM CdSO4组细胞的胰岛素水平和SOD活性呈降低趋势,MDA含量呈升高趋势,但与对照组相比均无统计学意义;而2μM和4μM CdSO4组细胞内的胰岛素水平（3.41 m IU/L、2.84 m IU/L）和SOD活性（13.59 U/mg protein、10.95 U/mg protein）,与对照组（6.65 m IU/L、16.48 U/mg protein）相比均降低（P<0.05）,以及2μM和4μM CdSO4组细胞MDA含量（15.44 nmol/mg protein、22.47nmol/mg protein）比对照组（8.94 nmol/mg protein）升高（P<0.05）。2、明确m6A修饰及其相关酶、LncRNAs在CdSO4致NIT-1细胞损伤中的变化规律:（1）m6A相关酶水平:2μM和4μM CdSO4组METTL3的m RNA水平分别为对照组的0.67倍和0.36倍（P<0.05）,FTO的m RNA水平为对照组的0.77倍和0.47倍（P<0.05）;（1μM、2μM和4μM）CdSO4组对应的METTL3蛋白水平分别为对照组的0.81倍、0.52倍和0.33倍,FTO蛋白水平分别为对照组的0.88倍、0.64倍和0.50倍,而各CdSO4浓度组的细胞内YTHDF1 m RNA水平和蛋白表达、YTHDF2 m RNA水平和蛋白表达、YTHDC1 m RNA水平和蛋白表达与对照组相比均无统计学差异。（2）LncRNAs水平:与对照组相比,（1μM、2μM和4μM）CdSO4组细胞中LncRNA-MALAT1水平分别为对照组的0.84倍、0.70倍、0.36倍（P<0.05）,LncRNA-PVT1水平分别为对照组的0.85倍、0.81倍和0.44倍（P<0.05）,而CdSO4暴露组细胞的LncRNA-TUG1、LncRNA-XIST和LncRNA-NEAT1水平与对照组相比均无统计学差异;（3）m6A与LncRNA水平相关性:（2μM、4μM）CdSO4处理组的细胞内总RNA上m6A修饰水平明显低于未处理组（P<0.05）,降低的m6A与LncRNA-PVT1和LncRNA-MALAT1水平呈正相关,其相关系数分别为0.8200和0.9152。3、BBWE对镉致NIT-1细胞损伤的影响:（1）细胞存活率和凋亡率:（0、0.4 mg/m L、0.8 mg/m L、1.6 mg/m L、3.2 mg/m L和6.4 mg/m L）BBWE处理NIT-1细胞24 h后,细胞存活率分别为100%、127.61%、153.07%、162.40%、140.78%和42.23%,与对照组比较,细胞存活率随BBWE处理浓度的增加呈现出先升高后下降的趋势（P<0.05）;在共处理过程中,（0.4 mg/m L和0.8 mg/m L）BBWE组的细胞存活率分别为130.06%和156.00%,4μM CdSO4的细胞存活率为52.19%,（0.4 mg/m L和0.8 mg/m L）BBWE分别与4μM CdSO4共处理后,细胞存活率分别为38.43%和31.70%（P<0.05）;在预处理条件下,（0.4 mg/m L和0.8 mg/m L）BBWE的细胞存活率分别为106.09%和116.15%,4μM CdSO4的细胞存活率为60.98%,（0.4 mg/m L和0.8 mg/m L）BBWE分别与4μM CdSO4共处理,细胞存活率分别为54.37%和51.39%（P<0.05）。此外,4μM CdSO4和0.8 mg/m L BBWE联合处理组细胞变圆、细胞核呈致密浓染,细胞凋亡率分别是0.8mg/m L BBWE组和4μM CdSO4组的5.06倍和1.31倍（P<0.05）;（2）细胞ROS水平:共处理下,镜下观察到对照组和0.8 mg/m L BBWE组细胞活性氧ROS较少,而0.8 mg/m L BBWE+4μM CdSO4组ROS明显增多,分别为BBWE组和CdSO4单染组的1.18倍和1.05倍（P<0.05）;（3）氧化损伤相关指标:BCA蛋白含量测定结果显示,0.8 mg/m L BBWE、4μM CdSO4和0.8 mg/m L BBWE+4μM CdSO4组细胞蛋白含量分别是对照组的0.86倍、0.67倍和0.79倍（P<0.05）,CdSO4组细胞蛋白含量是BBWE组的0.78倍（P<0.05）;在4μM CdSO4单染组和0.8 mg/m L BBWE与4μM CdSO4共处理组中细胞MDA含量升高,分别是对照组的1.70倍和1.48倍、是BBWE组的1.79倍和1.55倍,差异均有统计学差异（P<0.05）;同时,与对照组SOD含量（175.01 U/mg protein）相比,0.8 mg/m L BBWE组、4μmol/L CdSO4组和0.8 mg/m L BBWE+4μmol/L CdSO4组细胞SOD含量依次为210.82 U/mg protein、122.73 U/mg protein和131.43 U/mg protein,且CdSO4组和联合处理组细胞SOD含量均降低（P<0.05）。结论1、随着CdSO4对胰岛β细胞NIT-1细胞暴露浓度的增加,细胞内抗氧化酶逐渐降低,脂质过氧化物MDA增加,细胞在高糖刺激下胰岛素分泌减少、细胞内ROS水平持续上升,最终引起细胞凋亡发生;2、在损伤的NIT-1细胞中,m6A修饰水平可能受到METTL3和FTO的共同调控,并且m6A修饰水平与被m6A修饰的LncRNAs（LncRNA-MALAT1、LncRNA-PVT1）在损伤细胞中呈正相关。3、低浓度下的白僵蚕水提物可促进NIT-1细胞的增殖,但无法拮抗CdSO4诱导的细胞损伤,反而增强了细胞毒性,表现为细胞内ROS水平增加、MDA含量升高以及SOD含量降低,其机制可能与细胞内抗氧化酶耗竭、凋亡和ROS水平增加有关。